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Amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa

Esquemas de amplificación RT-LAMP, ejemplificados para la detección del SARS-CoV-2 .

La amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa ( RT-LAMP ) es un método de amplificación de ácidos nucleicos de un solo paso para multiplicar secuencias específicas de ARN. Se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas causadas por virus de ARN . [1]

Combina la detección de ADN LAMP [2] con la transcripción inversa , creando ADNc a partir de ARN antes de ejecutar la reacción. [3] RT-LAMP no requiere ciclos térmicos (a diferencia de la PCR ) y se realiza a una temperatura constante entre 60 y 65 °C.

La RT-LAMP se utiliza en la detección de virus de ARN (grupos II, IV y V del sistema de clasificación de virus de Baltimore ), como el virus SARS-CoV-2 [4] y el virus del Ébola . [5]

Aplicaciones

RT-LAMP se utiliza para comprobar la presencia de muestras de ARN específicas de virus para la secuencia específica del virus, lo que es posible comparando las secuencias con una gran base de datos externa de referencias.

Detección del virus SARS-CoV2

La técnica RT-LAMP está siendo apoyada como una alternativa más barata y sencilla a la RT-PCR para el diagnóstico temprano de personas que son infecciosas para COVID-19 . [6] Existen diseños de pruebas de acceso abierto (incluidas las proteínas recombinantes ) que hacen legalmente posible que cualquier persona produzca una prueba. A diferencia de las pruebas rápidas clásicas de flujo lateral , la RT-LAMP permite el diagnóstico temprano de la enfermedad mediante la prueba del ARN viral . [7]

Las pruebas se pueden realizar sin aislamiento previo de ARN, detectando los virus directamente a partir de hisopos [8] o de saliva . [9]

Detección de virus no humanos

Un ejemplo de uso de RT-LAMP fue un experimento para detectar un nuevo virus BYD similar al del pato Tembusu, llamado así por la región, Baiyangdian , donde se aisló por primera vez [10] [11] [1] Otra aplicación reciente de este método fue en un experimento de 2013 para detectar un virus Akabane utilizando RT-LAMP. El experimento, realizado en China, aisló el virus de fetos de terneros abortados. [12]

Detección de fluidos corporales

La RT-LAMP también se utiliza en serología forense para identificar fluidos corporales. Los investigadores han realizado experimentos para demostrar que este método puede identificar de manera eficaz ciertos fluidos corporales. Sabiendo que habría limitaciones, Su et al. llegaron a la conclusión de que la RT-LAMP solo podía identificar sangre. [13] [14]

Metodología

Transcripción inversa

Se detecta una secuencia específica del ADNc mediante 4 cebadores LAMP . Dos de ellos son cebadores internos (FIP y BIP), que sirven como base para que la enzima Bst copie la plantilla en un nuevo ADN. Los cebadores externos (F3 y B3) se unen a la cadena de plantilla y ayudan a que la reacción se lleve a cabo.

Al igual que en el caso de la RT-PCR , el procedimiento RT-LAMP comienza fabricando ADN a partir del ARN de muestra. Esta conversión la realiza una transcriptasa inversa , una enzima derivada de retrovirus capaz de realizar dicha conversión. [15] Este ADN derivado del ARN se llama ADNc o ADN complementario. El cebador FIP es utilizado por la transcriptasa inversa para construir una copia de ADN de cadena sencilla. El cebador F3 se une también a este lado de la cadena molde y desplaza la copia realizada previamente.

Amplificación

Esta copia desplazada de cadena sencilla es una mezcla de ARN diana y cebadores. Los cebadores están diseñados para tener una secuencia que se une a la secuencia misma, formando un bucle.

El cebador BIP se une al otro extremo de esta cadena sencilla y es utilizado por la ADN polimerasa Bst para construir una cadena complementaria, lo que da lugar a una cadena doble de ADN. El cebador F3 se une a este extremo y desplaza, una vez más, esta molécula de ADN monocatenario recién generada .

Esta nueva cadena simple que se ha liberado actuará como punto de partida para la amplificación del ciclo LAMP. Este ADN monocatenario tiene una estructura similar a una mancuerna , ya que los extremos se pliegan y se unen entre sí, formando dos bucles.

La ADN polimerasa y los cebadores FIP o BIP continúan amplificando esta cadena y el producto de la reacción LAMP se extiende. Este ciclo puede iniciarse tanto desde el lado anterior como posterior de la cadena utilizando el cebador adecuado. Una vez que este ciclo ha comenzado, la cadena experimenta una síntesis de ADN autocebada durante la etapa de elongación del proceso de amplificación. Esta amplificación tiene lugar en menos de una hora, en condiciones isotérmicas entre 60 y 65 °C.

Leer

La lectura de las pruebas RT-LAMP es frecuentemente colorimétrica. Dos de las formas más comunes se basan en la medición del pH o de los iones de magnesio . La reacción de amplificación hace que el pH baje y los niveles de Mg2+ bajen. Esto se puede percibir mediante indicadores, como el rojo fenol , para el pH, y el azul de hidroxinaftol (HNB), para el magnesio. [15] Otra opción es utilizar SYBR Green I , un agente colorante intercalante del ADN. [16]

Detección colorimétrica de reacciones RT-LAMP en tubos Eppendorf.

Ventajas y desventajas

Ejemplo de configuración de RT-LAMP en un baño de agua, que requiere equipo económico en el BioCenter de Viena .

Este método es especialmente ventajoso porque se puede realizar todo rápidamente en un solo paso. La muestra se mezcla con los cebadores, la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa y la reacción se lleva a cabo a una temperatura constante. La temperatura requerida se puede alcanzar utilizando un simple baño de agua caliente.

La PCR requiere termociclado ; la RT-LAMP no, lo que la hace más eficiente en términos de tiempo y costo-efectividad. [3] Este método económico y simplificado se puede utilizar más fácilmente en países en desarrollo que no tienen acceso a laboratorios de alta tecnología.

Una desventaja de este método es la generación de cebadores específicos de la secuencia. Para cada ensayo LAMP, los cebadores deben diseñarse específicamente para que sean compatibles con el ADN objetivo. Esto puede resultar difícil, lo que desalienta a los investigadores a utilizar el método LAMP en su trabajo. [1] Sin embargo, existe un software gratuito llamado Primer Explorer, desarrollado por Fujitsu en Japón, que puede ayudar en la selección de estos cebadores.

Véase también

Referencias

  1. ^ abc Mori Y, Notomi T (2009). "Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP): un método de diagnóstico rápido, preciso y rentable para enfermedades infecciosas". J. Infect. Chemother . 15 (2): 62–9. doi :10.1007/s10156-009-0669-9. PMC  7087713 . PMID  19396514.
  2. ^ Notomi, Tsugunori; Okayama, Hiroto; Masubuchi, Harumi; Yonekawa, Toshihiro; Watanabe, Keiko; Amino, Nobuyuki; Hase, Tetsu (15 de junio de 2000). "Amplificación isotérmica de ADN mediada por bucles". Investigación de ácidos nucleicos . 28 (12): e63. doi :10.1093/nar/28.12.e63. ISSN  0305-1048. PMC 102748 . PMID  10871386. 
  3. ^ ab Fu S, Qu G, Guo S, Ma L, Zhang N, Zhang S, Gao S, Shen Z (2011). "Aplicaciones de la amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle". Appl. Biochem. Biotechnol . 163 (7): 845–50. doi :10.1007/s12010-010-9088-8. PMID  20844984. S2CID  45682156.
  4. ^ Habibzadeh, Parham; Mofatteh, Mohammad; Silawi, Mohammad; Ghavami, Saeid; Faghihi, Mohammad Ali (17 de febrero de 2021). "Ensayos de diagnóstico molecular para COVID-19: una descripción general". Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences . 58 (6): 385–398. doi :10.1080/10408363.2021.1884640. ISSN  1549-781X. PMC 7898297 . PMID  33595397. 
  5. ^ Kurosaki, Yohei; Magassouba, N'Faly; Oloniniyi, Olamide K.; Cherif, Mahamoud S.; Sakabe, Saori; Takada, Ayato; Hirayama, Kenji; Yasuda, Jiro (22 de febrero de 2016). "Desarrollo y evaluación del ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) junto con un dispositivo portátil para el diagnóstico rápido de la enfermedad por el virus del Ébola en Guinea". PLOS Enfermedades tropicales desatendidas . 10 (2): e0004472. doi : 10.1371/journal.pntd.0004472 . ISSN  1935-2735. PMC 4764121 . PMID  26900929. 
  6. ^ "La prueba basada en LAMP podría permitir la realización de pruebas de COVID-19 en el punto de atención". Diagnósticos de Technology Networks . Consultado el 31 de julio de 2020 .
  7. ^ Alekseenko, Alisa; Barrett, Donal; Pareja-Sánchez, Yerma; Howard, Rebecca J.; Strandback, Emilia; Ampah-Korsah, Henry; Rovšnik, Urška; Zúñiga-Véliz, Silvia; Klenov, Alejandro; Malloo, Jayshna; Sí, Shenglong (19 de enero de 2021). "Detección directa de SARS-CoV-2 utilizando reactivos RT-LAMP no comerciales en muestras inactivadas por calor". Informes científicos . 11 (1): 1820. Bibcode : 2021NatSR..11.1820A. doi : 10.1038/s41598-020-80352-8 . ISSN  2045-2322. PMC 7815738 . PMID  33469065. 
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  9. ^ Nagura-Ikeda, Mayu; Imai, Kazuo; Tabata, Sakiko; Miyoshi, Kazuyasu; Murahara, Nami; Mizuno, Tsukasa; Horiuchi, Midori; Kato, Kento; Imoto, Yoshitaka; Iwata, Maki; Mimura, Satoshi (24 de agosto de 2020). "Evaluación clínica de la saliva recolectada por uno mismo mediante PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR), RT-qPCR directa, amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa y una prueba rápida de antígeno para diagnosticar COVID-19". Revista de Microbiología Clínica . 58 (9). doi : 10.1128/JCM.01438-20 . ISSN  0095-1137. PMC 7448663 . Número de modelo:  PMID32636214. 
  10. ^ Vaidya NK, Wang FB, Zou X, Wahl LM (2012). "Dinámica de transmisión del virus BYD recientemente identificado que causa el síndrome de caída de los huevos de pato". PLOS ONE . ​​7 (4): e35161. Bibcode :2012PLoSO...735161V. doi : 10.1371/journal.pone.0035161 . PMC 3329443 . PMID  22529985. 
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  12. ^ Qiao J, Wang J, Meng Q, Wang G, Liu Y, He Z, Yang H, Zhang Z, Cai X, Chen C (2013). "Detección rápida del virus Akabane mediante un nuevo ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP)". Virol. J. 10 : 288. doi : 10.1186/1743-422X-10-288 . PMC 3848447. PMID  24034624 . 
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  16. ^ Bokelmann, Lukas; Nickel, Olaf; Maricic, Tomislav; Paabo, Svante; Meyer, Matthias; Borte, Stephan; Riesenberg, Stephan (6 de agosto de 2020). "Pruebas masivas rápidas, confiables y económicas en el punto de atención para SARS-CoV-2 mediante la combinación de captura de hibridación con LAMP colorimétrico mejorado (Cap-iLAMP)". medRxiv 10.1101/2020.08.04.20168617 . 

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