La toxina B de Clostridioides difficile ( TcdB ) es una citotoxina producida por la bacteria Clostridioides difficile . Es uno de los dos tipos principales de toxinas producidas por C. difficile , siendo el otro una enterotoxina relacionada( Toxina A ). Ambos son muy potentes y letales. [2] [3]
La toxina B (TcdB) es una citotoxina que tiene un peso molecular de 270 kDa y un punto isoeléctrico , pl, de 4,1. [4] La toxina B tiene cuatro dominios estructurales diferentes: catalítico , cisteína proteasa , translocación y unión al receptor . [5] El dominio catalítico de la glucosiltransferasa N-terminal incluye los residuos de aminoácidos 1 a 544, mientras que el dominio de cisteína proteasa incluye los residuos 545 a 801. Además, la región de translocación incorpora residuos de aminoácidos del 802 al 1664, mientras que la región de unión al receptor es parte de la región C-terminal e incluye residuos de aminoácidos del 1665 al 2366. [5]
La actividad de glicosilación de la toxina B se produce en la región catalítica N-terminal (residuos 1 a 544). Esta región glicosila sustratos independientemente de cualquier actividad citotóxica. [6] Sin embargo, una pequeña eliminación de la región de unión al receptor provoca una atenuación de la actividad de la toxina B. [6] La región de translocación contiene una estructura hidrofóbica similar a un tallo, que puede ayudar a los residuos 958-1130 a formar poros que atraviesan la membrana . [5] La región de unión al receptor que incluye la región repetitiva C-terminal (CRR) aumenta la interacción con la membrana TcdB pero no participa en la formación de poros. [7] Además, la cisteína proteasa y las regiones de translocación tienen estructuras complejas que desempeñan un papel funcional importante en la translocación y la unión al receptor. [8] Sin embargo, la eliminación de la región de translocación de los aminoácidos disminuye la actividad citotóxica 4 veces. Tanto las cisteína proteasas como la mayoría de las regiones de translocación albergan proteínas hidrofóbicas , que muestran acceso a TcdB y otras toxinas que cruzan las membranas celulares . [8]
El C-terminal de TcdB (la región verde de la Fig. 2) contiene una región conocida como oligopéptidos repetitivos combinados (CROP) que contiene los residuos de aminoácidos 1831–2366. [9] Estos CULTIVOS constituyen entre 19 y 24 repeticiones cortas (SR) de aminoácidos, aproximadamente 31 repeticiones largas (LR) de aminoácidos, la toxina A y la toxina B. [9] [10] La región de CULTIVOS TcdB consta de 19 SR y 4 LR. Esta región SR y LR permite la formación de motivos de unión a la pared celular que ayudan a unir restos de azúcar de las superficies celulares. [9]
Para purificar la toxina B de cultivos de células de C. difficile , se utiliza caldo de infusión de cerebro y corazón porque promueve la síntesis de la toxina B. [11] El método de filtración facilita la purificación de la toxina B del sobrenadante de C. difficile . La concentración de toxina del sobrenadante es proporcional al recuento de células del organismo. Muchos estudios han propuesto que la mayoría de las toxinas se liberan en la fase logarítmica tardía o en las fases estacionarias tempranas , por lo que las células secretan continuamente la toxina B. [2] Aunque hay muchos métodos empleados por diferentes estudios para purificar la toxina B, la mayoría de los estudios utilizan métodos que involucran concentraciones de sulfato de amonio ultrafiltrado o precipitación , en lugar de filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico . Además, la eficacia del método de cromatografía de intercambio iónico ayuda a diferenciar entre TcdA y TcdB. [ cita necesaria ]
Cuando el residuo catalítico de treonina de la glucosiltransferasa desactiva una familia de pequeñas GTPasas , por ejemplo, la familia Rho ; Rac y Cdc42 dentro de las células diana alteran los mecanismos de transducción de señales , lo que conduce a una disfunción del citoesqueleto de actina , la unión célula - célula y la apoptosis (Fig. 5). [12] [13] [14] Rho induce la actividad de las fibras de estrés de actina . Las proteínas Rac controlan las actividades de agitación de la membrana y de los neutrófilos con NADPH -oxidasa . "Cdc42 regula la formación de filamentos de actina F en filopodios ". [ cita necesaria ]
Varios estudios han demostrado que la presencia de TcdB en células de mamíferos conduce a cambios rápidos en la morfología y la señalización celular . En un corto período de tiempo, las células tienen apariencia de placa con pequeñas dosis de TcdB y TcdA. Además, la muerte de las células es un impacto importante de estas toxinas después de que las células han sido intoxicadas . Una investigación de Donta et al., señaló que TcdB tiene graves impactos en otras células de mamíferos, como las células de ovario de hámster chino , las células epiteliales cervicales humanas , las células suprarrenales de ratón , los hepatocitos de rata y los astrocitos de rata (Fig.3). [15] [16]
La actividad citotóxica se basa en los tipos de células, que pueden oscilar entre 4 y 200 veces. Generalmente, cuando las células se infectan con TcdB, no sólo pierden su integridad estructural, sino también disminuciones de los filamentos de actina F. [17] Los rondas celulares mediante TcdB no tardan más de 2 horas (Fig. 4), pero en lo que respecta a la muerte celular , puede tardar aproximadamente 24 horas. [15] Con respecto a la diarrea asociada a C. difficile (CDAD), los efectos de la citopaticidad son más críticos que la muerte celular real porque una vez que las células pierden la integridad del filamento de actina del citoesqueleto , también pierden su función normal. [ cita necesaria ]
La causa de la actividad citotóxica de TcdB dentro de la célula huésped está mediada principalmente por la endocitosis del receptor [ cita requerida ] . Los endosomas ácidos permiten que la toxina B entre al citosol . Este fenómeno tiene lugar mediante una región receptora de unión , que permite que la toxina ingrese a las células huésped [ cita necesaria ] . A través de la accesibilidad del citosol de las células huésped , TcdB desactiva las GTPasas pequeñas (Fig. 5), por ejemplo, los miembros de la familia Rho Rac y Cdc42 mediante el proceso de glicosilación de treonina 35 en Cdc42 y Rac, y treonina 37 en Rho. [18] [19] Estas Rho GTPasas se encuentran ubicuamente en el citosol de las células eucariotas que son responsables de la organización del citoesqueleto de actina porque las toxinas en el citosol causan la condensación de los filamentos de actina como consecuencia del redondeo celular y la formación de ampollas en la membrana (Fig. 3), que finalmente conduce a la apoptosis . [20] [21] TcdB provoca cambios críticos en la dinámica y morfología celular . La Figura 3 muestra el probable efecto de la toxina B en la superficie de una célula; ampollas en la membrana (flechas negras). [22] Además, TcdB inactiva las Rho GTPasas. Como consecuencia, se alteran las uniones entre células, lo que aumenta la permeabilidad epitelial de la toxina B y la acumulación de líquido en la luz. Este es uno de los principales agentes causantes de la diarrea asociada a C. difficile (CDAD) (Fig. 5). [23] [24]
Además, la tasa de hidrólisis por TcdB de UDP-glucosa es aproximadamente cinco veces mayor que la de TcdA. [25] Varios estudios han indicado que Rho exhibe modificación postraduccional a través de prenilación y carboximetilación, que ocurre en el lado citoplasmático de la membrana plasmática , por lo tanto, el intercambio de GTP a GDP . [26] Cuando TcdB se une a Rho y otras GTPasas pequeñas , el GTP se hidroliza a GDP , lo que conduce a que el GTP esté unido (activo) a GDP (inactivo) (Fig. 5). Además, esta actividad de intercambio está regulada por factores de guanina en el citosol de la célula. [27]
La regulación celular de Rho, Rac y Cdc42 tiene efectos fuera de la vecindad de los filamentos de actina del citoesqueleto (Fig. 4), [17] Estas pequeñas GTPasas se incorporan en el ciclo celular que regula las señales a través de proteínas quinasas quinasas activadas por mitógenos. (MAPKK). [28] Algunas partes fisiológicas de las células que no están involucradas en los filamentos de actina pueden no causar el redondeo celular o la muerte celular de inmediato, pero en la actividad de la vía posterior, pueden conducir al deterioro de los filamentos de actina y, finalmente, a la muerte celular . [17]
En 1993, un estudio realizado por Shoshan et al. demostró que las células con TcdB cambiaban la actividad de la fosfolipasa A2 . Este fue un evento independiente de la alteración del citoesqueleto de actina . [29] Shoshan et al., también demostraron que TcdB inhibía la actividad de señalización del receptor desactivando las proteínas Rho a través de la fosfolipasa D. [29]
TcdB accede al interior de la célula a través de endocitosis mediada por clatrina , [30] Cuando la toxina B es parte del citosol , la glucosiltransferasa pasa a través de la membrana endosómica , lo que disminuye el pH, induce la translocación y finalmente conduce a cambios morfológicos de los residuos de la región de translocación ( 958-1130). [31] Las regiones hidrofóbicas están incrustadas en la membrana del huésped para formar poros que permiten el paso de los dominios de glucosiltransferasa . [31] Cuando las células se infectan con TcdB en un ambiente ácido, atenúa las toxinas y provoca reordenamientos de forma (Fig. 6). [31] Como consecuencia del pH ácido, TcdB muestra claras diferencias en la fluorescencia original del triptófano , la susceptibilidad de las proteasas y las superficies hidrofóbicas . [31] Otro grupo ha demostrado que la acidificación conduce a cambios conformacionales de la toxina y, lo que es más importante, ayuda a formar poros. [7] Una supuesta región de translocación (Fig. 2) constituye aproximadamente 801 a 1400 aminoácidos, de los cuales los residuos 958 a 1130 son hidrofóbicos y son responsables de la formación de poros transmembrana. [20] La mayoría de los estudios utilizaron la cepa 630 de TcdB para mostrar la actividad de formación de poros de las toxinas de C. difficile . [31]
Para ver si los efectos de la escisión proteolítica de TcdB tienen lugar en la superficie celular o en endosomas ácidos , los estudios utilizaron bafilomicina A1 , que se sabe que bloquea las H + -ATPasas tipo v de los endosomas. Esto reduce la acidez en los endosomas. [31] La vía de absorción fisiológica de TcdB previene la actividad citopática de TcdB. [31] Cuando las células estuvieron en condiciones ácidas (pH 4,0) durante 5 minutos después de unir TcdB a la superficie celular a 37 grados Celsius, se observaron reordenamientos de forma y redondeos. Sin embargo, cuando las células redondeadas se incubaron durante una hora adicional a pH neutro (7,0) con parámetros similares, no se observó ningún redondeo celular. [15] [31] Ambos estudios demostraron que la toxina B tiene una propiedad de escisión proteolítica , que es fundamental para el acceso al citosol . [7] [15] [31] Tener un pH ácido del endosoma conduce a alteraciones topológicas de TcdB (Figura 6). [7]
El gen que codifica la proteína TcdB, tcdB , se encuentra dentro de la región cromosómica de 19,6 kb . Esto se conoce como locus de patogenicidad o PaLoc (Figura 2). [32] [33] El marco de lectura abierto (ORF) para tcdB tiene una longitud de 7098 nucleótidos . [17] Es importante mencionar que, además de los genes de toxinas principales en la región PaLoc, hay otros tres genes accesorios que codifican en la región PaLoc: tcdR (L), tcdC (R) y tcdE en el medio. Estos genes ayudan a regular la expresión de TcdA y TcdB. También ayudan a secretar o liberar toxinas de la célula. [17] El gen codificante tcdE , ubicado entre tcdB y tcdA, es análogo a las proteínas holina , por lo que se sugiere que tcdE funciona como un gen facilitador que mejora la liberación o secreción de TcdA y TcdB, aumentando en consecuencia la permeabilidad de la célula huésped. membrana . [17]
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Existen diferentes tamaños de plásmidos de C. difficile . Los pesos moleculares detectados oscilan entre 2,7x106 y 100x106 , pero los tamaños de los plásmidos no muestran correlación con la toxicidad . Para detectar el nivel de toxina B en C. difficile , los médicos utilizan ampliamente ensayos de cultivos celulares derivados de muestras de heces de pacientes con PMC . [2] [3] El ensayo de cultivo celular se considera un "estándar de oro" para detectar la toxicidad en C. difficile porque una pequeña cantidad de toxina B es capaz de provocar el redondeo celular (Fig. 4), por lo que es una prueba importante. Aprovechamiento de los laboratorios clínicos para realizar correlaciones con la CDAD causada por TcdB. [2] [3] Aunque se encontró actividad citotóxica de las toxinas clostridiales grandes (LCT) en muestras de heces de pacientes con PMC, la actividad de la toxina B tuvo efectos citotóxicos más perjudiciales en comparación con la toxina A. [2] Por lo tanto, la actividad de la toxina A está atenuada cuando no se aísla de la toxina B. [2] [3] La detección de la toxicidad de C. difficile es extremadamente sensible; sin embargo, el uso del ensayo de cultivo celular permite a los laboratorios clínicos superar el desafío; el uso de dosis tan pequeñas como 1 pg/ml de toxina B es suficiente para provocar el redondeo celular. [2] [3] Esta es la principal ventaja de utilizar el ensayo de cultivo de tejido para detectar toxicidad en pacientes con PMC . [2] Aunque los laboratorios clínicos han intentado utilizar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) en placa de microtitulación y otras técnicas para detectar la actividad citotóxica de la toxina B en las heces de pacientes con PMC , los resultados no son tan precisos como aquellos donde Se utilizaron ensayos de cultivo celular . [2] [3] [34]
Al agregar un antimicrobiano , por ejemplo clindamicina , al medio de crecimiento del cultivo, los estudios han demostrado que la actividad citotóxica en cultivos de C. difficile aumenta entre 4 y 8 veces. [35] [36] Además, conociendo el papel de los antibióticos en las causas de PMC, muchos estudios anteriores se centraron en los efectos de los antimicrobianos en la producción de toxinas. Como resultado, los estudios pudieron concluir que la naturaleza subinhibitoria de los niveles de vancomicina y penicilina aumentaba la producción de toxinas en cultivos de C. difficile . [37] Las cantidades de producción de toxinas se correlacionaron con el uso de medio de crecimiento para los organismos. Otro estudio ilustró que los altos niveles de producción de toxina de TcdB se observaron en medios complejos como el caldo de infusión de cerebro y corazón . [38] [39] Se produjeron altos niveles de toxinas con el aislamiento de sustancias altamente virulentas . Por el contrario, se produjeron niveles bajos de toxinas con el aislamiento de débilmente virulentos . Así, se demuestra que la producción de toxinas estaba co-regulada. Aunque no se comprende el mecanismo detrás de la participación del medio ambiente en la modulación de las señales que expresan las toxinas, los estudios in vitro han demostrado que la expresión de la toxina se ve reforzada por la represión de catabolitos y el estrés, por ejemplo, los antibióticos . [40] [41] [42] Otro estudio ha demostrado que limitar la biotina en un medio bien caracterizado aumenta la producción de TcdB 64 veces y la de TcdA 35 veces. Esto se hizo con C. difficile y dosis de biotina tan pequeñas como 0,05 nM. [41] Varios otros estudios iniciales han argumentado en contra de la teoría de que la producción de toxina tiene algo que ver con el estrés o la represión catabólica de la toxina TcdA o TcdB. [42] Además, muchos estudios dicen que la razón principal de las diferencias entre otros estudios se debe a que la producción de toxinas no ocurre con todos los aislados de C. difficile . [ cita necesaria ]
Muchos estudios iniciales han sugerido que la toxina A (también conocida como TcdA) es la proteína toxina principal que causa la diarrea asociada a antibióticos (DAA); sin embargo, los investigadores científicos de la última década han demostrado que la toxina B (o TcdB) desempeña un papel más importante en las enfermedades de lo que nadie había pronosticado. Con este conocimiento, la toxina B ha sido identificada como el principal factor de virulencia que causa la apertura de uniones estrechas de las células epiteliales intestinales , lo que permite que la toxina aumente la permeabilidad vascular e induzca hemorragia . Por lo tanto, esto lleva a que el factor de necrosis tumoral α (TNF α) y las interleucinas proinflamatorias se establezcan como los principales agentes causantes de la colitis pseudomembranosa (PMC) y la diarrea asociada a antibióticos (AAD). [2] [3] [43]
La participación de la toxina A y, lo más importante, de la toxina B es el elemento clave que determina la enfermedad causada por C. difficile . Los laboratorios clínicos han identificado estas toxinas en las heces de los pacientes basándose en ensayos de anticuerpos y citotoxicidad . [44] Se ha demostrado que estas toxinas bacterianas están asociadas con la toxina hemorrágica de Clostridium sordellii (TcsH), la toxina letal (TcsL) y la toxina alfa de Clostridium novyi (Tcn α), lo que convierte a esta cohorte en la gran familia de toxinas clostridiales. . [17] Debido a las similitudes de estas toxinas con otras, los investigadores las han clasificado como la familia de las grandes toxinas clostridiales (LCT). [9]
Bezlotoxumab es un anticuerpo monoclonal humano diseñado para la prevención de la recurrencia de infecciones por Clostridium difficile. Mediante la estructura cristalizada por rayos X del N-terminal de TcdB, se identifica que la toxina consta de tres dominios: un dominio de glucosiltransferasa (GTD), una cisteína proteasa y un dominio de oligopéptido repetitivo combinado (CROP). Bezlotoxumab se une específicamente a dos sitios homólogos dentro del dominio CROP de TcdB. El análisis estructural mediante cristalografía de rayos X indica que la unión del anticuerpo ocluye parcialmente las supuestas bolsas de unión a carbohidratos. De acuerdo con esta idea, Bezlotoxumab bloquea la unión de TcdB a células de mamíferos. [45]
En las primeras etapas de la enfermedad de PMC , muchos estudios han especulado que la TcdA es más potente que la TcdB. Esto se ha deducido de experimentos in vivo donde la producción de toxinas de TcdA fue más grave que la de TcdB con cecitis por antibióticos. [38] [46] Posteriormente, varios estudios demostraron que TcdB desempeña un papel importante en la enfermedad de PMC y ADD. El estudio demostró que, aunque C. difficile no produce TcdA, aún presenta síntomas de la enfermedad. [47] Además, estudios posteriores han demostrado que una forma purificada de TcdB es una enterotoxina más letal en comparación con la TcdA, y también que el epitelio intestinal está gravemente dañado y provoca una respuesta inflamatoria aguda. [48] Con una mejor comprensión de la toxina, los investigadores pudieron afirmar que TcdB es el principal factor de virulencia que causa CDI sobre TcdA. Sin embargo, cuando TcdA está presente en el intestino, ayuda a facilitar que la actividad de TcdB tenga impactos más amplios y, en consecuencia, afecte a múltiples sistemas de órganos. [49] Además, cuando se vacunaron hámsteres contra TcdA, se demostró que no estaban completamente protegidos contra la enfermedad de C. difficile y esto llevó a que los estudios concluyeran que TcdB es muy letal y potente. [50] Además, inyectar una pequeña dosis de TcdA con una dosis letal de TcdB por vía intravenosa o intraperitoneal resultó suficiente para causar la muerte de un animal. Por tanto, TcdA actúa como facilitador de la salida de TcdB del intestino. [50]