Un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total ( TIRFM ) es un tipo de microscopio con el que se puede observar una región delgada de una muestra, normalmente de menos de 200 nanómetros.
La TIRFM es una modalidad de obtención de imágenes que utiliza la excitación de células fluorescentes en una sección delgada de muestra óptica que se encuentra apoyada sobre un portaobjetos de vidrio. La técnica se basa en el principio de que cuando la luz de excitación se refleja internamente en su totalidad en un cubreobjetos sólido transparente en su interfaz con un medio líquido, se genera un campo electromagnético, también conocido como onda evanescente, en la interfaz sólido-líquido con la misma frecuencia que la luz de excitación. [1] La intensidad de la onda evanescente decae exponencialmente con la distancia desde la superficie del sólido, de modo que solo las moléculas fluorescentes dentro de unos pocos cientos de nanómetros del sólido se excitan de manera eficiente. De este modo, se pueden obtener imágenes bidimensionales de la fluorescencia, aunque también existen mecanismos en los que se puede obtener información tridimensional sobre la ubicación de vesículas o estructuras en las células. [2]
En 1910 se introdujo la fluorescencia de campo amplio, una técnica óptica que ilumina toda la muestra. [3] Luego, en 1960, se introdujo la microscopía confocal, que disminuyó el fondo y el tiempo de exposición de la muestra al dirigir la luz a un punto preciso e iluminar conos de luz en la muestra. En la década de 1980, la introducción de la TIRFM disminuyó aún más el fondo y el tiempo de exposición al iluminar solo la sección delgada de la muestra que se estaba examinando. [3]
Existen dos métodos comunes para producir la onda evanescente para TIRFM. [1] El primero es el método del prisma, que utiliza un prisma para dirigir el láser hacia la interfaz entre el cubreobjetos y el medio/células en un ángulo de incidencia suficiente para provocar una reflexión interna total. Esta configuración se ha aplicado a la microscopía celular durante más de 30 años, pero nunca se ha convertido en una herramienta convencional debido a varias limitaciones. Aunque existen muchas variaciones de la configuración del prisma, la mayoría restringe el acceso a la muestra, lo que dificulta la realización de manipulaciones, la inyección de medios en el espacio de la muestra o la realización de mediciones fisiológicas. [2] Otra desventaja es que en la mayoría de las configuraciones basadas en los diseños de microscopios invertidos, la iluminación se introduce en el lado de la muestra opuesto a la óptica del objetivo, lo que requiere la obtención de imágenes de la región del campo evanescente a través de la mayor parte de la muestra. Se requiere una gran complejidad y precisión para obtener imágenes de este sistema, lo que significó que el método del prisma no fue utilizado por muchos biólogos, sino que se limitó a su uso por parte de los físicos.
El otro método se conoce como el método de lente objetivo, que ha aumentado el uso de TIRFM en microscopía celular y ha aumentado aún más desde que se encuentra disponible una solución comercial. [2] En este mecanismo, se puede cambiar fácilmente entre fluorescencia de campo amplio estándar y TIRF modificando la posición fuera del eje del foco del haz en el plano focal posterior del objetivo. Hay varias formas desarrolladas para cambiar las posiciones del haz, como usar un actuador que puede cambiar la posición en relación con el iluminador de fluorescencia que está conectado al microscopio.
En biología celular y molecular , se han estudiado una gran cantidad de eventos moleculares en las superficies celulares, como la adhesión celular , la unión de células por hormonas , la secreción de neurotransmisores y la dinámica de membranas con microscopios de fluorescencia convencionales . Sin embargo, los fluoróforos que están unidos a la superficie de la muestra y los del medio circundante existen en un estado de equilibrio . Cuando estas moléculas se excitan y se detectan con un microscopio de fluorescencia convencional, la fluorescencia resultante de esos fluoróforos unidos a la superficie a menudo se ve abrumada por la fluorescencia de fondo debido a la población mucho mayor de moléculas no unidas. La TIRFM permite la excitación selectiva de los fluoróforos unidos a la superficie, mientras que las moléculas no unidas no se excitan y no emiten fluorescencia. Debido al hecho de la selectividad de superficie submicrónica, la TIRFM se ha convertido en un método de elección para la detección de moléculas individuales.
Existen muchas aplicaciones de la TIRFM en la microscopía celular. Algunas de estas aplicaciones incluyen:
Con la capacidad de resolver vesículas individuales ópticamente y seguir la dinámica de sus interacciones directamente, TIRFM proporciona la posibilidad de estudiar la gran cantidad de proteínas involucradas en procesos neurobiológicos de una manera que antes no era posible. [2]
La TIRFM ofrece varias ventajas sobre la microscopía de fluorescencia confocal y de campo amplio estándar, como:
La idea de utilizar la reflexión interna total para iluminar las células que entran en contacto con la superficie del vidrio fue descrita por primera vez por EJ Ambrose en 1956. [4] Esta idea fue luego ampliada por Daniel Axelrod [5] en la Universidad de Michigan, Ann Arbor a principios de los años 1980 como TIRFM. Una TIRFM utiliza una onda evanescente para iluminar y excitar selectivamente los fluoróforos en una región restringida de la muestra inmediatamente adyacente a la interfaz vidrio-agua. El campo electromagnético evanescente decae exponencialmente desde la interfaz y, por lo tanto, penetra hasta una profundidad de solo aproximadamente 100 nm en el medio de la muestra. Por lo tanto, la TIRFM permite una visualización selectiva de regiones de la superficie como la membrana plasmática basal (que tiene un espesor de aproximadamente 7,5 nm) de las células. Sin embargo, tenga en cuenta que la región visualizada tiene al menos unos pocos cientos de nanómetros de ancho, por lo que la zona citoplasmática inmediatamente debajo de la membrana plasmática se visualiza necesariamente además de la membrana plasmática durante la microscopía TIRF. La visualización selectiva de la membrana plasmática reproduce las características y los eventos de la membrana plasmática en células vivas con alta resolución axial .
La microscopía TIRF también se puede utilizar para observar la fluorescencia de una sola molécula , [6] [7] lo que la convierte en una herramienta importante de la biofísica y la biología cuantitativa. La microscopía TIRF también se ha aplicado en la detección de moléculas individuales de biomarcadores de ADN y la discriminación de SNP. [8]
Se ha demostrado que la geometría cis (TIRFM a través del objetivo) y la geometría trans (TIRFM basada en prismas y guías de luz) proporcionan una calidad diferente del efecto de reflexión interna total. En el caso de la geometría trans, la trayectoria de luz de excitación y el canal de emisión están separados, mientras que en el caso de la TIRFM de tipo objetivo comparten el objetivo y otros elementos ópticos del microscopio. Se ha demostrado que la geometría basada en prismas genera una onda evanescente limpia, cuya descomposición exponencial está cerca de la función predicha teóricamente. [9] Sin embargo, en el caso de la TIRFM basada en objetivos, la onda evanescente está contaminada con luz parásita intensa . Se ha demostrado que la intensidad de la luz parásita asciende al 10-15% de la onda evanescente, lo que dificulta la interpretación de los datos obtenidos por la TIRFM de tipo objetivo [10] [11]
Los componentes básicos del dispositivo TIRFM incluyen:
Las diferencias clave entre la TIRFM basada en objetivos (cis) y la basada en prismas (trans) son que la TIRFM basada en prismas requiere el uso de una interfaz prisma/solución para generar el campo evanescente, mientras que la TIRFM basada en objetivos no requiere un prisma y utiliza una interfaz cubreobjetos/solución para generar el campo evanescente. Por lo general, las TIRFM basadas en objetivos son las más utilizadas, pero tienen una calidad de imagen reducida debido al ruido de luz difusa dentro de la onda evanescente.
La TIRFM se basa en el fenómeno óptico de la reflexión interna total , en el que las ondas que llegan a una interfaz de medio no se transmiten al medio 2, sino que se reflejan completamente de vuelta al medio 1. La reflexión interna total requiere que el medio 2 tenga un índice de refracción menor que el medio 1, y que las ondas incidan en ángulos suficientemente oblicuos en la interfaz. Un fenómeno observado que acompaña a la reflexión interna total es la onda evanescente , que se extiende espacialmente de forma perpendicular desde la interfaz hacia el medio 2, y decae exponencialmente, como un factor de longitud de onda, índice de refracción y ángulo de incidencia. Es la onda evanescente la que se utiliza para lograr una mayor excitación de los fluoróforos cerca de la superficie de la muestra y una menor excitación de los fluoróforos superfluos dentro de la solución.
Para fines prácticos, en la TIRF basada en objetivos, el medio 1 es típicamente un cubreobjetos de vidrio con un índice de refracción alto y el medio 2 es la muestra en solución con un índice de refracción más bajo. Puede haber aceite de inmersión entre la lente y el cubreobjetos de vidrio para evitar una refracción significativa a través del aire.
El ángulo crítico de incidencia de la luz excitatoria se puede derivar de la ley de Snell :
Para el índice de refracción de la muestra, el índice de refracción del cubreobjetos.
Así, a medida que el ángulo de incidencia alcanza , comenzamos a observar efectos de reflexión interna total y de onda evanescente, y a medida que lo supera estos efectos son más frecuentes.
La intensidad de la onda evanescente viene dada por:
Con profundidad de penetración dada por:
Por lo general, ≤~100 nanómetros, que suele ser mucho más pequeño que la longitud de onda de la luz y mucho más delgado que un corte de microscopios confocales . [1] [12]
Para la obtención de imágenes TIRFM, la longitud de onda del haz de excitación dentro de la muestra se puede seleccionar mediante filtrado. Además, el rango de ángulos de incidencia está determinado por la apertura numérica (NA) del objetivo y requiere que NA > . Este parámetro se puede ajustar modificando el ángulo en el que el haz de excitación entra en la lente del objetivo. Por último, los índices de reflexión ( ) de la solución y el cubreobjetos se pueden determinar experimentalmente o los fabricantes pueden informarlos.
Para las técnicas complejas de microscopía fluorográfica, los láseres son la fuente de luz preferida, ya que son muy uniformes, intensos y casi monocromáticos. Sin embargo, se observa que las fuentes de luz ARC LAMP y otros tipos de fuentes también pueden funcionar. Por lo general, la longitud de onda del haz de excitación se designa según los requisitos de los fluoróforos dentro de la muestra; las longitudes de onda de excitación más comunes se encuentran en el rango de 400 a 700 nm para las muestras biológicas.
En la práctica, una caja de luz generará un láser multicromático de alta intensidad, que luego se filtrará para permitir que pasen las longitudes de onda deseadas para excitar la muestra. En el caso de la TIRFM basada en objetivos, el haz de excitación y el haz de emisión fluorescente se capturarán a través de la misma lente objetivo. Por lo tanto, para dividir los haces, se utiliza un espejo dicromático para reflejar el haz de excitación entrante hacia la lente objetivo y permitir que el haz de emisión pase a través del detector. Puede ser necesario un filtrado adicional para separar aún más las longitudes de onda de emisión y excitación.
Cuando se excitan con longitudes de onda de luz específicas, los colorantes fluoróforos reemitirán luz en longitudes de onda más largas (que contienen menos energía). En el contexto de TIRFM, solo los fluoróforos cercanos a la interfaz serán excitados fácilmente por el campo evanescente, mientras que los que estén más allá de los ~100 nm serán altamente atenuados. La luz emitida por los fluoróforos no será dirigida y, por lo tanto, pasará a través de la lente del objetivo en diferentes ubicaciones con intensidades variables. Esta señal luego pasará a través del espejo dicromático y continuará hasta el detector.
Los cubreobjetos de vidrio suelen tener un índice de reflexión de alrededor de , mientras que el índice de refracción del aceite de inmersión es comparable . El medio de aire, que tiene un índice de refracción de , provocaría la refracción del haz de excitación entre el objetivo y el cubreobjetos, por lo que el aceite se utiliza para amortiguar la región y evitar interacciones de interfaz superfluas antes de que el haz alcance la interfaz entre el cubreobjetos y la muestra.
La apertura numérica (NA) del objetivo especifica el rango de ángulos en los que el sistema puede aceptar o emitir luz.
Para lograr los mayores ángulos de incidencia, es deseable pasar la luz en un ángulo fuera del eje a través de las periferias de la lente.
El plano focal posterior (también llamado "plano de apertura") es el plano a través del cual se enfoca el haz excitatorio antes de pasar a través del objetivo. Ajustar la distancia entre el objetivo y el plano focal posterior puede producir diferentes aumentos de imagen, ya que el ángulo de incidencia será más o menos pronunciado. El haz debe pasar a través del plano focal posterior fuera del eje para pasar a través del objetivo en sus extremos, permitiendo que el ángulo sea lo suficientemente mayor que el ángulo crítico. El haz también debe enfocarse en el plano focal posterior porque esto garantiza que la luz que pasa a través del objetivo esté colimada, interactuando con el cubreobjetos en el mismo ángulo y, por lo tanto, toda reflejada internamente. [12]
La muestra debe adsorberse en la superficie del cubreobjetos de vidrio y teñirse con fluoróforos adecuados para resolver las características deseadas en la muestra. Esto se realiza de acuerdo con el protocolo de cualquier otra técnica de microscopía de fluorescencia .
El filtro dicroico es un filtro de borde que se utiliza en un ángulo de incidencia oblicuo (normalmente 45°) para reflejar de forma eficiente la luz en la banda de excitación y transmitirla en la banda de emisión. El ángulo de 45° del filtro separa la trayectoria del haz de excitación y de emisión. El filtro está compuesto por un sistema complejo de múltiples capas de metales, sales metálicas y dieléctricos que se han depositado al vacío sobre un vidrio fino. [13] Este revestimiento está diseñado para tener una alta reflectividad para longitudes de onda más cortas y una alta transmisión para longitudes de onda más largas. [14] Mientras que el filtro transmite la luz de excitación seleccionada (longitud de onda más corta) a través del objetivo y sobre el plano de la muestra, también pasa la luz de fluorescencia de emisión (longitud de onda más larga) al filtro de barrera y refleja cualquier luz de excitación dispersa de vuelta en la dirección de la fuente láser. [15] Esto maximiza la cantidad de radiación de excitación que pasa a través del filtro y el haz de fluorescencia emitido que es detectado por el detector. [16]
El filtro de barrera bloquea principalmente las longitudes de onda no deseadas, especialmente las longitudes de onda de luz de excitación más cortas. Por lo general, se trata de un filtro de paso de banda que deja pasar solo las longitudes de onda emitidas por el fluoróforo y bloquea toda la luz no deseada fuera de esta banda. Los microscopios más modernos permiten cambiar el filtro de barrera según la longitud de onda de la emisión específica del fluoróforo. [13]
La imagen es detectada por una cámara digital con dispositivo acoplado por carga (CCD). Las cámaras CCD tienen detectores de fotones, que son obleas delgadas de silicio, ensambladas en matrices 2D de regiones sensibles a la luz. Las matrices de detectores capturan y almacenan información de la imagen en forma de carga eléctrica localizada que varía con la intensidad de la luz incidente. [2] Como se muestra en el esquema, los fotones se transforman en electrones por los detectores y los electrones se convierten en una señal eléctrica legible en la placa de circuito. [17] Luego, la señal eléctrica se convoluciona con una función de dispersión de puntos (PSF) para muestrear la señal original. Como tal, la resolución de la imagen depende en gran medida de la cantidad de detectores y la función de dispersión de puntos determinará la resolución de la imagen. [18]
La mayoría de las técnicas de obtención de imágenes por fluorescencia presentan ruido de fondo debido a la iluminación y reconstrucción de grandes cortes (en la dirección z) de las muestras. Dado que la TIRFM utiliza una onda evanescente para fluorescer un corte fino de la muestra, hay inherentemente menos ruido de fondo y artefactos. Sin embargo, todavía hay otros ruidos y artefactos como el ruido de Poisson, las aberraciones ópticas, el fotoblanqueo y otras moléculas fluorescentes.
El ruido de Poisson es una incertidumbre fundamental en la medición de la luz. Esto provocará incertidumbres durante la detección de fotones de fluorescencia. [18] Si se miden N fotones en una medición particular, existe una probabilidad del 63 % de que el valor promedio real esté en el rango entre N +√N y N −√N. [19] Este ruido puede provocar una representación errónea del objeto en ubicaciones de píxeles incorrectas.
Las aberraciones ópticas pueden surgir de la difracción de la luz de fluorescencia o de la desalineación del microscopio y del objetivo. La difracción de la luz en el portaobjetos de muestra puede propagar la señal de fluorescencia y provocar imágenes borrosas. De manera similar, si hay una desalineación entre la lente del objetivo, el filtro y el detector, el haz de excitación o emisión puede no estar enfocado y provocar imágenes borrosas. [14]
El fotoblanqueo puede ocurrir cuando los enlaces covalentes o no covalentes en los fluoróforos son destruidos por la luz de excitación y ya no pueden fluorescer. [20] Las sustancias fluorescentes siempre se degradarán hasta cierto punto por la energía de la radiación de excitación y harán que la fluorescencia se desvanezca y dé como resultado una imagen oscura y borrosa. [21] El fotoblanqueo es inevitable, pero se puede minimizar evitando la exposición a la luz no deseada y utilizando aceites de inmersión para minimizar la dispersión de la luz. [13]
La autofluorescencia puede ocurrir en ciertas estructuras celulares donde el compuesto natural en la estructura fluorescería después de ser excitado a longitudes de onda relativamente más cortas (similares a la longitud de onda de excitación). [18] La fluorescencia inducida también puede ocurrir cuando ciertos compuestos no autofluorescentes se vuelven fluorescentes después de unirse a ciertas sustancias químicas (como el formaldehído). [13] Esta fluorescencia puede dar lugar a artefactos o ruido de fondo en la imagen. El ruido de otros compuestos fluorescentes se puede eliminar de forma eficaz utilizando filtros para capturar la longitud de onda de fluorescencia deseada o asegurándose de que los compuestos autofluorescentes no estén presentes en la muestra.
Las técnicas de fluorescencia modernas intentan incorporar métodos para eliminar algunas distorsiones y ruidos. Las aberraciones ópticas son generalmente deterministas (son constantes durante todo el proceso de la imagen y en diferentes muestras). [18] La distorsión determinista se puede eliminar deconvolucionando la señal y restando el artefacto conocido. La técnica de deconvolución simplemente utiliza una transformada de Fourier inversa para obtener la señal de fluorescencia original y eliminar el artefacto. [19]
Sin embargo, se ha demostrado que la deconvolución sólo funciona si hay una señal de fluorescencia fuerte o cuando el ruido está claramente identificado. Además, la deconvolución funciona mal porque no incluye información estadística y no puede reducir el ruido no determinista, como el ruido poissoniano. Para obtener una mejor resolución y calidad de imagen, los investigadores han utilizado técnicas estadísticas para modelar la probabilidad de distribución de los fotones en el detector. [18] [22] Esta técnica, llamada método de máxima verosimilitud , se está mejorando aún más mediante algoritmos para mejorar su velocidad de rendimiento. [22]
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