El superenrollamiento del ADN se refiere a la cantidad de torsión en una cadena de ADN en particular , lo que determina la cantidad de tensión sobre ella. Una hebra determinada puede estar "superenrollada positivamente" o "superenrollada negativamente" (enrollada más o menos apretadamente). La cantidad de superenrollamiento de una hebra afecta una serie de procesos biológicos, como la compactación del ADN y la regulación del acceso al código genético (lo que afecta fuertemente el metabolismo del ADN y posiblemente la expresión genética). Ciertas enzimas, como las topoisomerasas , cambian la cantidad de superenrollamiento del ADN para facilitar funciones como la replicación y transcripción del ADN . [1] La cantidad de superenrollamiento en una hebra determinada se describe mediante una fórmula matemática que la compara con un estado de referencia conocido como ADN de "forma B relajada".
En un segmento de doble hélice "relajado" de ADN-B , las dos hebras se retuercen alrededor del eje helicoidal una vez cada 10,4 a 10,5 pares de bases de secuencia . Agregar o restar giros, como lo hacen algunas enzimas , impone tensión. Si un segmento de ADN bajo tensión de torsión se cierra formando un círculo uniendo sus dos extremos y luego se le permite moverse libremente, adquiere una forma diferente, como la figura de un ocho. Esta forma se conoce como superenrollamiento . (La forma sustantiva "superespiral" se utiliza a menudo al describir la topología del ADN ).
El ADN de la mayoría de los organismos suele estar superenrollado negativamente. Se vuelve temporalmente superenrollado positivamente cuando se replica o transcribe. Estos procesos se inhiben (regulan) si no se relaja rápidamente. La forma más simple de una superenrollamiento es la figura de un ocho; una cadena de ADN circular asume esta forma para acomodar más o pocos giros helicoidales. Los dos lóbulos de la figura ocho aparecerán girados en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario entre sí, dependiendo de si la hélice está sobre o insuficientemente enrollada. Por cada giro helicoidal adicional que se acomode, los lóbulos mostrarán una rotación más alrededor de su eje. [2]
Las contorsiones lobales de un ADN circular, como la rotación de los lóbulos en forma de ocho de arriba, se denominan contorsiones . El ejemplo anterior ilustra que torcerse y retorcerse son interconvertibles. El superenrollamiento se puede representar matemáticamente mediante la suma de torsión y contorsión. La torsión es el número de vueltas helicoidales en el ADN y la contorsión es la cantidad de veces que la doble hélice se cruza sobre sí misma (estas son las superenrollamientos). Los giros extrahelicoidales son positivos y provocan un superenrollamiento positivo, mientras que los giros sustractivos provocan un superenrollamiento negativo. Muchas enzimas topoisomerasas detectan el superenrollamiento y lo generan o lo disipan a medida que cambian la topología del ADN.
En parte porque los cromosomas pueden ser muy grandes, los segmentos del medio pueden actuar como si sus extremos estuvieran anclados. Como resultado, es posible que no puedan distribuir el exceso de torsión al resto del cromosoma o absorber la torsión para recuperarse del enrollamiento insuficiente; en otras palabras, los segmentos pueden volverse superenrollados . En respuesta al superenrollamiento, asumirán una cierta contorsión, como si sus extremos estuvieran unidos.
El ADN superenrollado forma dos estructuras; un plectonema o un toroide , o una combinación de ambos. Una molécula de ADN superenrollada negativamente producirá una hélice izquierda de un inicio, el toroide, o una hélice derecha de dos inicios con bucles terminales, el plectonema. Los plectonemas suelen ser más comunes en la naturaleza y esta es la forma que adoptarán la mayoría de los plásmidos bacterianos. En el caso de moléculas más grandes, es común que se formen estructuras híbridas: un bucle en un toroide puede extenderse hasta formar un plectonema. Si todas las espiras de un toroide se extienden, se convierte en un punto de bifurcación en la estructura plectonémica. El superenrollamiento del ADN es importante para el empaquetado del ADN dentro de todas las células y parece desempeñar también un papel en la expresión genética. [3] [4]
Basándose en las propiedades de las moléculas intercaladas , es decir, la fluorescencia al unirse al ADN y desenrollar los pares de bases del ADN, en 2016 se introdujo una técnica de molécula única para visualizar directamente los plectonemas individuales a lo largo del ADN superenrollado [5], lo que permitiría estudiar más a fondo las interacciones de las proteínas procesadoras de ADN con el ADN superenrollado. En ese estudio, se utilizó Sytox Orange (un tinte intercalante) para inducir el superenrollamiento en moléculas de ADN unidas a la superficie.
Utilizando este ensayo , se descubrió que la secuencia de ADN codifica la posición de los superenrollamientos plectonémicos. [6] Además, se descubrió que las superenrollamientos de ADN estaban enriquecidas en los sitios de inicio de la transcripción en procariotas .
El superenrollamiento del ADN es importante para el empaquetado del ADN dentro de todas las células. Debido a que la longitud del ADN puede ser miles de veces mayor que la de una célula, empaquetar este material genético en la célula o el núcleo (en eucariotas ) es una tarea difícil. El superenrollamiento del ADN reduce el espacio y permite empaquetar el ADN. En los procariotas, los superenrollamientos plectonémicos son predominantes, debido al cromosoma circular y a una cantidad relativamente pequeña de material genético. En eucariotas, el superenrollamiento del ADN existe en muchos niveles de superenrollamientos plectonémicos y solenoidales, siendo el superenrollamiento solenoidal el más eficaz para compactar el ADN. El superenrollamiento solenoide se logra con histonas para formar una fibra de 10 nm. Esta fibra se enrolla aún más en una fibra de 30 nm y se enrolla sobre sí misma muchas veces más.
El empaquetamiento del ADN aumenta considerablemente durante la mitosis cuando los ADN hermanos duplicados se segregan en células hijas. Se ha demostrado que la condensina , un gran complejo proteico que desempeña un papel central en el ensamblaje de los cromosomas mitóticos, induce superenrollamientos positivos de una manera dependiente de la hidrólisis de ATP in vitro . [7] [8] El superenrollamiento también podría desempeñar un papel importante durante la interfase en la formación y mantenimiento de dominios de asociación topológica (TAD). [9]
El superenrollamiento también es necesario para la síntesis de ADN/ARN . Debido a que el ADN debe desenrollarse para la acción de la ADN/ARN polimerasa , se producirán superenrollamientos. La región situada delante del complejo de la polimerasa se desenrollará; este estrés se compensa con superenrollamientos positivos delante del complejo. Detrás del complejo, el ADN se rebobina y habrá superenrollamientos negativos compensatorios . Las topoisomerasas como la ADN girasa (topoisomerasa tipo II) desempeñan un papel en el alivio de parte del estrés durante la síntesis de ADN/ARN. [10]
Las proteínas especializadas pueden descomprimir pequeños segmentos de la molécula de ADN cuando ésta se replica o transcribe en ARN . Pero un trabajo publicado en 2015 ilustra cómo el ADN se abre por sí solo. [3] [4]
Simplemente girar el ADN puede exponer las bases internas al exterior, sin la ayuda de ninguna proteína. Además, la transcripción misma contorsiona el ADN en las células humanas vivas, tensando algunas partes de la espiral y aflojándola en otras. Esa tensión desencadena cambios de forma, en particular la apertura de la hélice para poder leerla. Desafortunadamente, estas interacciones son muy difíciles de estudiar porque las moléculas biológicas cambian de forma con mucha facilidad. En 2008 se observó que la transcripción retuerce el ADN, dejando a su paso un rastro de ADN subenrollado (o superenrollado negativamente). Además, descubrieron que la propia secuencia de ADN afecta la forma en que la molécula responde al superenrollamiento. [3] [4]
Por ejemplo, los investigadores identificaron una secuencia específica de ADN que regula la velocidad de transcripción; A medida que la cantidad de superenrollamiento aumenta y disminuye, ralentiza o acelera el ritmo al que la maquinaria molecular lee el ADN. [3] Se plantea la hipótesis de que estos cambios estructurales podrían desencadenar estrés en otros lugares a lo largo de su longitud, lo que a su vez podría proporcionar puntos desencadenantes para la replicación o expresión genética. [3] [4] Esto implica que es un proceso muy dinámico en el que tanto el ADN como las proteínas influyen en cómo actúa y reacciona el otro. [3]
Casi la mitad de los genes de la bacteria E. coli que se reprimen durante el shock por frío se reprimen de manera similar cuando el antibiótico novobiocina bloquea la girasa. [11] Además, durante los choques fríos, la densidad de los nucleoides aumenta y la proteína girasa y el nucleoide se colocalizan (lo que es consistente con una reducción en la relajación del ADN). Esto es evidencia de que la reducción del superenrollamiento negativo del ADN es uno de los principales mecanismos responsables del bloqueo de la transcripción de la mitad de los genes que conducen el programa de respuesta transcripcional de choque frío de las bacterias. En base a esto, se ha propuesto un modelo estocástico de este proceso. Este modelo se ilustra en la figura, donde las reacciones 1 representan la transcripción y su bloqueo debido al superenrollamiento. Mientras tanto, las reacciones 2 a 4 modelan, respectivamente, la traducción y la degradación de ARN y proteínas. [11]
En la naturaleza, el ADN circular siempre está aislado como una hélice sobre hélice de orden superior, conocida como superhélice . En las discusiones sobre este tema, el giro Watson-Crick se denomina devanado "secundario" y las superhélices como devanado "terciario". El boceto de la derecha indica una doble hélice de Watson-Crick "relajada" o "circular abierta" y, junto a ella, una superhélice diestra. La estructura "relajada" de la izquierda no se encuentra a menos que se corte el cromosoma; la superhélice es la forma que se encuentra habitualmente en la naturaleza.
Para fines de cálculos matemáticos, una superhélice diestra se define como una que tiene un número "negativo" de vueltas superhélice, y una superhélice zurda se define como una que tiene un número "positivo" de vueltas superhélice. En el dibujo (que se muestra a la derecha), tanto el devanado secundario ( es decir, "Watson-Crick") como el devanado terciario ( es decir, "superhelicoidal") son diestros, por lo tanto, los supergiros son negativos (–3 en este ejemplo). ).
Se supone que la superhelicidad es el resultado de un devanado insuficiente, lo que significa que hay una deficiencia en el número de giros secundarios de Watson-Crick. Un cromosoma así se tensará, del mismo modo que se tensa un resorte metálico macroscópico cuando se lo enrolla demasiado o se lo desenrolla. En el ADN así tensado aparecerán supergiros.
El superenrollamiento del ADN se puede describir numéricamente mediante cambios en el número de enlace Lk . El número de enlace es la propiedad más descriptiva del ADN superenrollado. Lk o , el número de vueltas en el plásmido/molécula de ADN relajado (tipo B), se determina dividiendo el total de pares de bases de la molécula por los pb relajados /vuelta que, dependiendo de la referencia, es 10,4; [12] 10,5; [13] [14] 10.6. [15]
Lk es el número de cruces que realiza una sola hebra a través de la otra, a menudo visualizado como el número de giros de Watson-Crick que se encuentran en un cromosoma circular en una proyección plana (generalmente imaginaria). Este número está físicamente "bloqueado" en el momento del cierre covalente del cromosoma y no puede modificarse sin que se rompa la cadena.
La topología del ADN se describe mediante la siguiente ecuación en la que el número de enlace es equivalente a la suma de Tw , que es el número de vueltas de la doble hélice, y Wr , que es el número de bobinas o "retorcimientos". " Si hay una molécula de ADN cerrada, la suma de Tw y Wr , o el número de enlace, no cambia. Sin embargo, puede haber cambios complementarios en Tw y Wr sin cambiar su suma:
Tw , llamado "giro", es el número de giros de Watson-Crick en el cromosoma cuando no está obligado a permanecer en un plano. Ya hemos visto que el ADN nativo suele ser superhélice. Si uno rodea el cromosoma retorcido en forma superhélice, contando los giros secundarios de Watson-Crick, ese número será diferente del número contado cuando el cromosoma está obligado a permanecer plano. En general, se espera que el número de giros secundarios en el cromosoma nativo superretorcido sea el número de enrollamiento "normal" de Watson-Crick, es decir, un único giro helicoidal de 10 pares de bases por cada 34 Å de longitud del ADN.
Wr , llamado "retorcerse", es el número de giros superhelicoidales. Dado que el ADN circular biológico suele estar insuficientemente enrollado, Lk generalmente será menor que Tw , lo que significa que Wr normalmente será negativo.
Si el ADN está insuficientemente enrollado, estará sometido a tensión, exactamente como se tensa un resorte metálico cuando se desenrolla con fuerza, y la aparición de supergiros permitirá al cromosoma aliviar su tensión adoptando supergiros negativos, que corrigen el desenrollado secundario de acuerdo con la ecuación de topología anterior.
La ecuación de topología muestra que existe una relación uno a uno entre los cambios en Tw y Wr . Por ejemplo, si se elimina un giro secundario "Watson-Crick", entonces se debe haber eliminado simultáneamente un supergiro hacia la derecha (o, si el cromosoma está relajado, sin supergiros, entonces se debe agregar un supergiro hacia la izquierda).
El cambio en el número de enlace, Δ Lk , es el número real de vueltas en el plásmido/molécula, Lk , menos el número de vueltas en el plásmido/molécula relajado Lk o :
Si el ADN está superenrollado negativamente, . El superenrollamiento negativo implica que el ADN está insuficientemente enrollado.
Una expresión estándar independiente del tamaño de la molécula es la "diferencia de enlace específica" o "densidad superhelicoidal" denotada σ , que representa el número de vueltas añadidas o eliminadas en relación con el número total de vueltas en la molécula/plásmido relajado, lo que indica el nivel de superenrollamiento.
La energía libre de Gibbs asociada con el bobinado viene dada por la siguiente ecuación [16]
La diferencia en energía libre de Gibbs entre el ADN circular superenrollado y el ADN circular desenrollado con N > 2000 pb se aproxima mediante:
o, 16 cal/pb.
Dado que el número de enlace L del ADN superenrollado es el número de veces que las dos cadenas se entrelazan (y ambas cadenas permanecen covalentemente intactas), L no puede cambiar. El estado de referencia (o parámetro) L 0 de un dúplex de ADN circular es su estado relajado. En este estado, se retuerce W = 0. Dado que L = T + W , en un estado relajado T = L. Por lo tanto, si tenemos un dúplex de ADN circular relajado de 400 pb, L ~ 40 (asumiendo ~10 pb por vuelta en B-DNA). Entonces T ~ 40 .
Los superenrollamientos negativos favorecen el desenrollado local del ADN, permitiendo procesos como la transcripción , la replicación del ADN y la recombinación . También se cree que el superenrollamiento negativo favorece la transición entre el ADN-B y el ADN-Z , y modera las interacciones de las proteínas de unión al ADN implicadas en la regulación genética . [17]
Se han propuesto algunos modelos estocásticos para explicar los efectos de la acumulación de superenrollamiento positivo (PSB) en la dinámica de la expresión génica (por ejemplo, en la expresión de genes bacterianos), que difieren, por ejemplo, en el nivel de detalle. En general, el detalle aumenta al agregar procesos afectados por y que afectan al superenrollamiento. A medida que se produce esta adición, aumenta la complejidad del modelo.
Por ejemplo, en [18] se proponen dos modelos de diferente complejidad. En el más detallado, los eventos se modelaron a nivel de nucleótidos, mientras que en el otro los eventos se modelaron solo en la región promotora y, por lo tanto, requirieron muchos menos eventos para tener en cuenta.
Se pueden encontrar ejemplos de modelos estocásticos que se centran en los efectos de PSB en la actividad de un promotor en:. [19] [20] En general, dichos modelos incluyen un promotor, Pro, que es la región del ADN que controla la transcripción y, por lo tanto, cuya actividad/bloqueo se ve afectado por PSB. También se incluyen moléculas de ARN (el producto de la transcripción), ARN polimerasas (RNAP) que controlan la transcripción y girasas (G) que regulan la PSB. Por último, es necesario que exista un medio para cuantificar la PSB en el ADN (es decir, el promotor) en cualquier momento dado. Esto se puede hacer teniendo algún componente en el sistema que se produzca con el tiempo (p. ej., durante eventos de transcripción) para representar superenrollamientos positivos y que se elimine mediante la acción de las girasas. Luego se puede configurar la cantidad de este componente para que afecte la tasa de transcripción.
Las propiedades topológicas del ADN circular son complejas. En los textos estándar, estas propiedades se explican invariablemente en términos de un modelo helicoidal para el ADN, pero en 2008 se observó que cada topoisómero, negativo o positivo, adopta una distribución única y sorprendentemente amplia de conformaciones tridimensionales. [4]
Cuando se determina el coeficiente de sedimentación, s , del ADN circular en un amplio rango de pH , se observan las siguientes curvas. Aquí se muestran tres curvas que representan tres especies de ADN. De arriba a abajo son: "Form IV" (verde), "Form I" (azul) y "Form II" (rojo).
"Forma I" (curva azul) es la nomenclatura tradicional utilizada para la forma nativa de ADN circular dúplex, recuperado de virus y plásmidos intracelulares. La Forma I está cerrada covalentemente y, por lo tanto, cualquier devanado plectonémico que pueda estar presente queda bloqueado. Si se introducen una o más muescas en la Forma I, se hace posible la rotación libre de una hebra con respecto a la otra, y la Forma II (curva roja) es visto.
La Forma IV (curva verde) es el producto de la desnaturalización alcalina de la Forma I. Se desconoce su estructura, excepto que es persistentemente dúplex y extremadamente densa.
Entre pH 7 y pH 11,5, el coeficiente de sedimentación s , para la Forma I, es constante. Luego desciende y, a un pH justo por debajo de 12, alcanza un mínimo. Con nuevos aumentos del pH, s vuelve a su valor anterior. Sin embargo, no se detiene ahí, sino que continúa aumentando sin descanso. A pH 13, el valor de s ha aumentado a casi 50, dos o tres veces su valor a pH 7, lo que indica una estructura extremadamente compacta.
Si luego se reduce el pH, el valor s no se restablece. En cambio, se ve la curva verde superior. El ADN, ahora en el estado conocido como Forma IV, permanece extremadamente denso, incluso si el pH se restablece al rango fisiológico original. Como se indicó anteriormente, la estructura de la Forma IV es casi completamente desconocida y actualmente no existe una explicación aceptada para su extraordinaria densidad. Lo único que se sabe acerca de la estructura terciaria es que es dúplex, pero no tiene enlaces de hidrógeno entre bases.
Se considera que estos comportamientos de las Formas I y IV se deben a las propiedades peculiares del ADN dúplex que se ha cerrado covalentemente en un círculo bicatenario. Si la integridad covalente se ve alterada incluso por una sola muesca en una de las hebras, todo ese comportamiento topológico cesa y se ve la curva inferior de la Forma II (Δ). Para la Forma II, las alteraciones del pH tienen muy poco efecto sobre la s . Sus propiedades físicas son, en general, idénticas a las del ADN lineal. A pH 13, las hebras de la Forma II simplemente se separan, tal como lo hacen las hebras del ADN lineal. Las hebras individuales separadas tienen valores de s ligeramente diferentes , pero no muestran cambios significativos en s con aumentos adicionales del pH.
Una explicación completa de estos datos está fuera del alcance de este artículo. En resumen, las alteraciones en s se producen debido a cambios en la superhelicidad del ADN circular. Estos cambios en la superhelicidad se ilustran esquemáticamente mediante cuatro pequeños dibujos que se han superpuesto estratégicamente a la figura de arriba.
Brevemente, se piensa ampliamente que las alteraciones de s observadas en la curva de titulación de pH anterior se deben a cambios en el devanado superhélice del ADN en condiciones de pH creciente. Hasta un pH de 11,5, el supuesto "enrollamiento insuficiente" produce una supergiro hacia la derecha ("negativa"). Pero a medida que el pH aumenta y la estructura helicoidal secundaria comienza a desnaturalizarse y desenrollarse, el cromosoma (si podemos hablar antropomórficamente) ya no "quiere" tener el devanado completo de Watson-Crick, sino que "quiere", cada vez más, estar "desenrollado". Dado que cada vez hay menos tensión que aliviar con el devanado superhélice, las superhélices desaparecen progresivamente a medida que aumenta el pH. A un pH justo por debajo de 12, todo incentivo para la superhelicidad ha expirado y el cromosoma aparecerá como un círculo abierto y relajado.
A un pH aún más alto, el cromosoma, que ahora se está desnaturalizando en serio, tiende a desenrollarse por completo, lo cual no puede hacer (porque Lk está bloqueado covalentemente). En estas condiciones, lo que antes se consideraba "insuficientemente enrollado" ahora se ha convertido en realidad en "sobreenrollado". Una vez más hay tensión, y una vez más es aliviada (al menos en parte) por la superhelicidad, pero esta vez en la dirección opuesta ( es decir, hacia la izquierda o "positiva"). Cada supergiro terciario zurdo elimina un único giro secundario Watson-Crick diestro , ahora indeseable .
La valoración finaliza a pH 13, donde aparece la Forma IV.
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