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subtilisina

La subtilisina es una proteasa (una enzima que digiere proteínas ) obtenida inicialmente del Bacillus subtilis . [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8]

Las subtilisinas pertenecen a las subtilasas , un grupo de serina proteasas que, como todas las serina proteasas, inician el ataque nucleofílico al enlace peptídico (amida) a través de un residuo de serina en el sitio activo . Las subtilisinas suelen tener pesos moleculares de 27 kDa. Se pueden obtener de ciertos tipos de bacterias del suelo , por ejemplo, Bacillus amyloliquefaciens del cual se secretan en grandes cantidades.

Nomenclatura

"Subtilisina" no se refiere a una sola proteína, sino a un clado completo bajo las subtilasas que contienen las subtilisinas clásicas. El clado se puede dividir en cuatro grupos: "subtilisinas verdaderas" (que contienen los miembros clásicos), "subtilisinas altamente alcalinas", "subtilisinas intracelulares" y "subtilisinas filogenéticamente intermedias" (PIS). [9] [10] Las subtilisinas notables incluyen:

Otros nombres no comerciales incluyen enzima ALK , bacilopeptidasa , proteinasa alcalina de Bacillus subtilis , colistinasa , genenasa I , proteasa XXVII , subtilopeptidasa , kazusasa , proteasa VIII , protina A 3L , proteasa S.

Otros nombres comerciales con identidades moleculares no identificadas incluyen SP 266 , orientase 10B (HBI Enzymes), Progress (Novozyme), Liquanase (Novozyme).

Estructura

La estructura de la subtilisina se ha determinado mediante cristalografía de rayos X. La forma madura es una proteína globular de 275 residuos con varias hélices alfa y una hoja beta grande . El N-terminal contiene un dominio propéptido I9 ( InterPro :  IPR010259 ) que ayuda al plegamiento de la subtilisina. La eliminación proteolítica del dominio activa la enzima. No tiene relación estructural con el clan de quimotripsina de las serina proteasas, pero utiliza el mismo tipo de tríada catalítica en el sitio activo . Esto lo convierte en un ejemplo clásico de evolución convergente .

Mecanismo de catálisis

El sitio activo presenta una red de retransmisión de carga que involucra Asp-32, His-64 y el sitio activo Ser-221 dispuestos en una tríada catalítica . La red de retransmisión de carga funciona de la siguiente manera: La cadena lateral de carboxilato de Asp-32 se une a un protón unido con nitrógeno en el anillo de imidazol de His-64 . Esto es posible porque Asp tiene carga negativa a pH fisiológico . El otro nitrógeno en His-64 forma enlaces de hidrógeno con el protón OH de Ser-221. Esta última interacción da como resultado la separación de carga de OH, siendo el átomo de oxígeno más nucleofílico. Esto permite que el átomo de oxígeno de Ser-221 ataque los sustratos entrantes (es decir, enlaces peptídicos), asistido por una cadena lateral de carboxiamida vecina de Asn-155.

Aunque Asp-32, His-64 y Ser-221 están secuencialmente muy separados, convergen en la estructura 3D para formar el sitio activo.

Para resumir las interacciones descritas anteriormente, Ser-221 actúa como nucleófilo y escinde enlaces peptídicos con su átomo de oxígeno parcialmente negativo. Esto es posible debido a la naturaleza del sitio de retransmisión de carga de la subtilisina.

Aplicaciones

Herramienta de búsqueda

En biología molecular que utiliza B. subtilis como organismo modelo , el gen que codifica la subtilisina ( aprE ) es a menudo el segundo gen de elección después de amyE para integrar construcciones informadoras, debido a su prescindibilidad.

Comercial

Las subtilisinas modificadas con proteínas se utilizan ampliamente en productos comerciales (la enzima nativa se inactiva fácilmente con detergentes y altas temperaturas) y también se denomina quitamanchas, por ejemplo, en detergentes para ropa [15] y lavavajillas , cosméticos , procesamiento de alimentos , [16 ] productos para el cuidado de la piel, limpiadores de lentes de contacto y para investigaciones en química orgánica sintética .

Seguridad y salud en el trabajo

Las personas pueden quedar expuestas a la subtilisina en el lugar de trabajo al inhalarla, tragarla, por contacto con la piel y con los ojos. El Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional (NIOSH) ha establecido un límite de exposición recomendado (REL) de 60 ng/m 3 durante un período de 60 minutos. [17]

La subtilisina puede provocar "asma por detergentes enzimáticos". Las personas sensibles a la subtilisina (Alcalase) generalmente también son alérgicas a la bacteria Bacillus subtilis . [18]

Referencias

  1. ^ AP : 1º2 ​; Bott R, Ultsch M, Kossiakoff A, Graycar T, Katz B, Power S (junio de 1988). "La estructura tridimensional de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens a 1,8 A y un análisis de las consecuencias estructurales de la inactivación del peróxido". La Revista de Química Biológica . 263 (16): 7895–906. doi : 10.1016/S0021-9258(18)68582-5 . PMID  3286644.
  2. ^ Ottesen M, Svendsen I (1970). Las subtilisinas . Métodos Enzimol. vol. 19. págs. 199-215. doi :10.1016/0076-6879(70)19014-8. ISBN 978-0-12-181881-4.
  3. ^ Markland FS, Smith EL (1971). "Subtilisinas: estructura primaria, propiedades químicas y físicas". En Boyer PD (ed.). Las enzimas . vol. 3 (3ª ed.). Nueva York: Academic Press. págs. 561–608.
  4. ^ Philipp M, Bender ML (1983). "Cinética de subtilisina y tiolsubtilisina". Bioquímica Molecular y Celular . 51 (1): 5–32. doi :10.1007/bf00215583. PMID  6343835. S2CID  24136200.
  5. ^ Nedkov P, Oberthür W, Braunitzer G (abril de 1985). "Determinación de la secuencia completa de aminoácidos de la subtilisina DY y su comparación con las estructuras primarias de las subtilisinas BPN ', Carlsberg y amylosacchariticus". Química biológica Hoppe-Seyler . 366 (4): 421–30. doi :10.1515/bchm3.1985.366.1.421. PMID  3927935.
  6. ^ Ikemura H, Takagi H, Inouye M (junio de 1987). "Requisito de pro-secuencia para la producción de subtilisina E activa en Escherichia coli". La Revista de Química Biológica . 262 (16): 7859–64. doi : 10.1016/S0021-9258(18)47646-6 . PMID  3108260.
  7. ^ Polgar L (1987). "Estructura y función de las serina proteasas". En Brocklehurst K, Neuberger A (eds.). Enzimas hidrolíticas . Ámsterdam: Elsevier. ISBN 0-444-80886-8.
  8. ^ Vasantha N, Thompson LD, Rhodes C, Banner C, Nagle J, Filpula D (septiembre de 1984). "Los genes de proteasa alcalina y proteasa neutra de Bacillus amyloliquefaciens contienen un gran marco de lectura abierto entre las regiones que codifican la secuencia señal y la proteína madura". Revista de Bacteriología . 159 (3): 811–9. doi :10.1128/JB.159.3.811-819.1984. PMC 215730 . PMID  6090391. 
  9. ^ Falkenberg, Fabián; Rahba, Jade; Fischer, David; Bott, Michael; Bongaerts, Johannes; Siegert, Petra (octubre de 2022). "Caracterización bioquímica de una nueva subtilisina altamente alcalina, halotolerante y oxidativamente estable de Alkalihalobacillus okhensis Kh10-101 T". FEBS Biografía abierta . 12 (10): 1729-1746. doi :10.1002/2211-5463.13457. PMC 9527586 . PMID  35727859. 
  10. ^ Falkenberg, F; Bott, M; Bongaerts, J; Siegert, P (2022). "Estudio filogenético de la familia de las subtilasas y búsqueda basada en la extracción de datos de nuevas subtilisinas de Bacillaceae". Fronteras en Microbiología . 13 : 1017978. doi : 10.3389/fmicb.2022.1017978 . PMC 9549277 . PMID  36225363. 
  11. ^ Eschenburg, S; Genov, N; Peters, K; Fittkau, S; Stoeva, S; Wilson, KS; Betzel, C (15 de octubre de 1998). "Estructura cristalina de la subtilisina DY, un mutante aleatorio de la subtilisina Carlsberg". Revista europea de bioquímica . 257 (2): 309–18. doi :10.1046/j.1432-1327.1998.2570309.x. PMID  9826175.
  12. ^ Betzel, C; Klupsch, S; Branner, S; Wilson, KS (1996). "Estructuras cristalinas de las proteasas alcalinas savinasa y esperasa de Bacillus lentus ". Avances en Medicina y Biología Experimentales. vol. 379, págs. 49–61. doi :10.1007/978-1-4613-0319-0_7. ISBN 978-0-306-45108-9. PMID  8796310.
  13. ^ Betzel, C; Klupsch, S; Papendorf, G; Hastrup, S; Branner, S; Wilson, KS (20 de enero de 1992). "Estructura cristalina de la proteinasa alcalina Savinasa de Bacillus lentus con una resolución de 1,4 A". Revista de biología molecular . 223 (2): 427–45. doi :10.1016/0022-2836(92)90662-4. PMID  1738156.
  14. ^ "THERMOASE PC10F de Amano Enzyme USA Co., Ltd. - Alimentos, bebidas y nutrición". www.ulprospector.com .
  15. ^ "Contenido del detergente para lavado Spar".
  16. ^ Chaplin M (20 de diciembre de 2004). "Aplicaciones de las proteasas en la industria alimentaria". Universidad del South Bank de Londres . Archivado desde el original el 14 de marzo de 2010 . Consultado el 3 de marzo de 2015 .
  17. ^ "CDC - Guía de bolsillo de NIOSH sobre peligros químicos - Subtilisinas". www.cdc.gov . Consultado el 21 de noviembre de 2015 .
  18. ^ Diccionario médico, de enfermería y de salud afines de Mosby, 14.a edición, página 557