Microscopía STED

Técnica en microscopía de fluorescencia

La microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) proporciona mejoras de resolución significativas en comparación con las posibles con la microscopía confocal .

La microscopía de agotamiento de emisión estimulada ( STED ) es una de las técnicas que componen la microscopía de súper resolución . Crea imágenes de súper resolución mediante la desactivación selectiva de fluoróforos , minimizando el área de iluminación en el punto focal y mejorando así la resolución alcanzable para un sistema dado. ^[1] Fue desarrollada por Stefan W. Hell y Jan Wichmann en 1994, ^[2] y fue demostrada experimentalmente por primera vez por Hell y Thomas Klar en 1999. ^[3] Hell recibió el Premio Nobel de Química en 2014 por su desarrollo. En 1986, VA Okhonin ^[4] (Instituto de Biofísica, Academia de Ciencias de la URSS, Rama Siberiana, Krasnoyarsk) había patentado la idea STED. ^[5] Esta patente era desconocida para Hell y Wichmann en 1994.

La microscopía STED es uno de los varios tipos de técnicas de microscopía de súper resolución que se han desarrollado recientemente para eludir el límite de difracción de la microscopía óptica y aumentar la resolución. La STED es una técnica funcional determinista que explota la respuesta no lineal de los fluoróforos que se utilizan habitualmente para etiquetar muestras biológicas con el fin de lograr una mejora en la resolución, es decir, la STED permite tomar imágenes a resoluciones inferiores al límite de difracción. Esto difiere de las técnicas funcionales estocásticas, como la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), ya que estos métodos utilizan modelos matemáticos para reconstruir un límite de subdifracción a partir de muchos conjuntos de imágenes limitadas por difracción.

Fondo

La fórmula de Ernst Abbe para el límite de difracción, grabada en piedra en un monumento en Jena .

Diagrama de Jablonski que muestra el corrimiento al rojo del fotón estimulado. Este corrimiento al rojo permite ignorar el fotón estimulado.

Diagrama del diseño de un dispositivo STED. El diseño de doble láser permite utilizar la excitación y la emisión estimulada en conjunto para STED.

En la microscopía tradicional, la resolución que se puede obtener está limitada por la difracción de la luz . Ernst Abbe desarrolló una ecuación para describir este límite. La ecuación es:

${\displaystyle \mathrm {D} ={\frac {\lambda }{2n\sin {\alpha }}}={\frac {\lambda }{\mathrm {2NA} }}}$

donde D es el límite de difracción, λ es la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica , o el índice de refracción del medio multiplicado por el seno del ángulo de incidencia. n describe el índice de refracción de la muestra, α mide el semiángulo sólido desde el cual un objetivo recoge la luz, λ es la longitud de onda de la luz utilizada para excitar la muestra y NA es la apertura numérica. Para obtener una alta resolución (es decir, valores d pequeños), las longitudes de onda cortas y los valores altos de NA (NA = n sinα) son óptimos. ^[6] Este límite de difracción es el estándar por el cual se miden todos los métodos de súper resolución. Debido a que STED desactiva selectivamente la fluorescencia, puede lograr una resolución mejor que la microscopía confocal tradicional. La fluorescencia normal ocurre al excitar un electrón desde el estado fundamental a un estado electrónico excitado de un nivel de energía fundamental diferente (S0 pasa a S1) que, después de relajarse de nuevo al estado fundamental (de S1), emite un fotón al caer desde S1 a un nivel de energía vibracional en S0. La STED interrumpe este proceso antes de que se libere el fotón. El electrón excitado se ve obligado a relajarse en un estado de vibración más alto que el que entraría en la transición de fluorescencia, lo que hace que el fotón que se libera se desplace hacia el rojo, como se muestra en la imagen de la derecha. ^[7] Debido a que el electrón va a un estado de vibración más alto, la diferencia de energía de los dos estados es menor que la diferencia de fluorescencia normal. Esta reducción de energía aumenta la longitud de onda y hace que el fotón se desplace más hacia el extremo rojo del espectro. Este cambio diferencia los dos tipos de fotones y permite ignorar el fotón estimulado.

Para forzar que se produzca esta emisión alternativa, un fotón incidente debe incidir en el fluoróforo. Esta necesidad de ser incidido por un fotón incidente tiene dos implicaciones para STED. En primer lugar, la cantidad de fotones incidentes afecta directamente la eficiencia de esta emisión y, en segundo lugar, con una cantidad suficientemente grande de fotones, la fluorescencia puede suprimirse por completo. ^[8] Para lograr la gran cantidad de fotones incidentes necesaria para suprimir la fluorescencia, el láser utilizado para generar los fotones debe ser de alta intensidad. Desafortunadamente, este láser de alta intensidad puede provocar el problema del fotoblanqueo del fluoróforo. El fotoblanqueo es el nombre que se le da a la destrucción de fluoróforos por luz de alta intensidad.

Proceso

Comparación entre la microscopía confocal y la microscopía STED. Se muestra la resolución mejorada de la microscopía STED en comparación con las técnicas tradicionales.

Punto de excitación (2D, izquierda), punto de desexcitación en forma de rosquilla (centro) y área restante que permite la fluorescencia (derecha).

El STED funciona reduciendo la fluorescencia en regiones específicas de la muestra mientras deja un punto focal central activo para emitir fluorescencia. Esta área focal se puede diseñar modificando las propiedades del plano pupilar de la lente del objetivo. ^{[9] [10] [11]} El ejemplo temprano más común de estos elementos ópticos difractivos, o DOE, es una forma de toro utilizada en el confinamiento lateral bidimensional que se muestra a continuación. La zona roja se agota, mientras que el punto verde se deja activo. Este DOE se genera mediante una polarización circular del láser de agotamiento, combinado con un vórtice óptico . La resolución lateral de este DOE suele estar entre 30 y 80 nm. Sin embargo, se han informado valores de hasta 2,4 nm. ^[12] Utilizando diferentes DOE, se ha demostrado una resolución axial del orden de 100 nm. ^[13] Una ecuación de Abbe modificada describe esta resolución de subdifracción como:

${\displaystyle \mathrm {D} ={\frac {\lambda }{2n\sin {\alpha }{\sqrt {1+{\frac {I}{I_{\text{sat}}}}}}}}={\frac {\lambda }{\mathrm {2NA} {\sqrt {1+\sigma }}}}}$

Donde es el índice de refracción del medio, es la intensidad intracavitaria y es la intensidad de saturación . Donde es el factor de saturación que expresa la relación entre la intensidad STED (máxima) aplicada y la intensidad de saturación, . ^{[6] [14]} ${\textstyle n}$ ${\textstyle I}$ ${\textstyle I_{\text{sat}}}$ ${\textstyle \sigma }$ ${\textstyle \sigma =I_{\text{max}}/I_{\text{sat}}}$

Para optimizar la eficacia del STED, la interferencia destructiva en el centro del punto focal debe ser lo más perfecta posible, lo que impone ciertas limitaciones a las ópticas que se pueden utilizar.

Tintes

Al principio del desarrollo de la STED, el número de colorantes que se podían utilizar en el proceso era muy limitado. La rodamina B fue nombrada en la primera descripción teórica de la STED. ^[2] Como resultado, los primeros colorantes utilizados fueron emisores láser en el espectro rojo. Para permitir el análisis STED de sistemas biológicos, los colorantes y las fuentes láser deben adaptarse al sistema. Este deseo de un mejor análisis de estos sistemas ha llevado a la STED de células vivas y a la STED multicolor, pero también ha exigido colorantes y sistemas de excitación cada vez más avanzados para dar cabida a la mayor funcionalidad. ^[7]

Uno de esos avances fue el desarrollo de células inmunomarcadas. Estas células son colorantes fluorescentes STED unidos a anticuerpos a través de enlaces amida. El primer uso de esta técnica acopló MR-121SE, un colorante rojo, con un anticuerpo antirratón secundario. ^[8] Desde esa primera aplicación, esta técnica se ha aplicado a una gama mucho más amplia de colorantes, incluidos los que emiten verde, Atto 532, ^{[15] [16] [17]} y los que emiten amarillo, Atto 590, ^[18], así como otros colorantes que emiten rojo. Además, Atto 647N se utilizó por primera vez con este método para producir STED de dos colores. ^[19]

Aplicaciones

En los últimos años, la técnica STED ha evolucionado desde una técnica compleja y muy específica hasta convertirse en un método de fluorescencia general. Como resultado, se han desarrollado varios métodos para ampliar la utilidad de la técnica STED y permitir que se proporcione más información.

Análisis estructural

Desde el comienzo del proceso, STED ha permitido que la microscopía de fluorescencia realice tareas que solo habían sido posibles utilizando la microscopía electrónica. Como ejemplo, STED se utilizó para la elucidación del análisis de la estructura de proteínas a nivel de suborgánulo. La prueba común de este nivel de estudio es la observación de filamentos del citoesqueleto. Además, los neurofilamentos , la actina y la tubulina se utilizan a menudo para comparar el poder de resolución de STED y los microscopios confocales. ^{[20] [21] [22]}

Utilizando STED, se ha logrado una resolución lateral de 70 – 90 nm al examinar SNAP25 , una proteína humana que regula la fusión de membranas. Esta observación ha demostrado que SNAP25 forma grupos independientemente de la funcionalidad del motivo SNARE y se une a la sintaxina agrupada. ^{[23] [24]} Los estudios de orgánulos complejos, como las mitocondrias, también se benefician de la microscopía STED para el análisis estructural. Utilizando microscopios STED hechos a medida con una resolución lateral de menos de 50 nm, se encontró que las proteínas mitocondriales Tom20 , VDAC1 y COX2 se distribuían como grupos a nanoescala. ^{[25] [26]} Otro estudio utilizó una microscopía STED casera y un tinte fluorescente de unión al ADN , midiendo longitudes de fragmentos de ADN con mucha más precisión que la medición convencional con microscopía confocal . ^[27]

Métodos correlativos

Debido a su función, la microscopía STED a menudo se puede utilizar con otros métodos de alta resolución. La resolución de la microscopía electrónica y de fuerza atómica es incluso mejor que la resolución STED, pero al combinar la fuerza atómica con la STED, Shima et al. pudieron visualizar el citoesqueleto de actina de células de cáncer de ovario humano mientras observaban cambios en la rigidez celular. ^[28]

Multicolor

El STED multicolor se desarrolló en respuesta a un problema creciente en el uso de STED para estudiar la dependencia entre la estructura y la función en las proteínas. Para estudiar este tipo de sistema complejo, se deben utilizar al menos dos fluoróforos separados. Usando dos pares de haces y colorantes fluorescentes, es posible obtener imágenes colocalizadas de grupos de proteínas sinápticas y mitocondriales con una resolución de hasta 5 nm [18]. El STED multicolor también se ha utilizado para demostrar que diferentes poblaciones de proteínas de vesículas sinápticas no se mezclan o escapan de los botones sinápticos. ^{[29] [30]} Al usar STED de dos colores con imágenes de múltiples vidas, es posible obtener STED de tres canales.

Célula viva

En un principio, se pensó que la STED era una técnica útil para trabajar con células vivas. ^[13] Desafortunadamente, la única forma de estudiar las células era etiquetar la membrana plasmática con colorantes orgánicos. ^[29] La combinación de STED con espectroscopia de correlación de fluorescencia mostró que los complejos moleculares mediados por colesterol atrapan esfingolípidos , pero solo de manera transitoria. ^[31] Sin embargo, solo las proteínas fluorescentes brindan la capacidad de visualizar cualquier orgánulo o proteína en una célula viva. Se demostró que este método funciona con una resolución lateral de 50 nm dentro de células de mamíferos que expresan citrina-tubulina. ^{[32] [33]} Además de detectar estructuras en células de mamíferos, la STED ha permitido la visualización de agrupaciones de proteínas PIN etiquetadas con YFP en la membrana plasmática de células vegetales. ^[34]

Recientemente, se realizó una STED de células vivas multicolor utilizando un láser rojo lejano pulsado y expresión de etiquetas CLIPf y SNAPf. ^[35]

En el cerebro de animales intactos

Las capas superficiales de la corteza del ratón se pueden visualizar repetidamente a través de una ventana craneal. ^[36] Esto permite seguir el destino y la forma de las espinas dendríticas individuales durante muchas semanas. ^[37] Con STED de dos colores, incluso es posible resolver la nanoestructura de la densidad postsináptica en animales vivos. ^[38]

STED a precios de video y más allá

La superresolución requiere píxeles pequeños, lo que significa más espacios para adquirir en una muestra dada, lo que conduce a un tiempo de adquisición más largo. Sin embargo, el tamaño del punto focal depende de la intensidad del láser que se utiliza para el agotamiento. Como resultado, este tamaño de punto se puede ajustar, cambiando el tamaño y la velocidad de obtención de imágenes. Luego se puede llegar a un compromiso entre estos dos factores para cada tarea de obtención de imágenes específica. Se han registrado velocidades de 80 cuadros por segundo, con puntos focales de alrededor de 60 nm. ^{[1] [39]} Se pueden alcanzar hasta 200 cuadros por segundo para campos de visión pequeños. ^[40]

Problemas

El fotoblanqueo puede ocurrir ya sea por excitación a un estado excitado aún más alto, o por excitación en el estado triplete. Para evitar la excitación de un electrón excitado a otro estado excitado más alto, la energía del fotón necesaria para desencadenar la emisión alternativa no debe superponerse a la energía de la excitación de un estado excitado a otro. ^[41] Esto asegurará que cada fotón láser que entre en contacto con los fluoróforos causará emisión estimulada, y no hará que el electrón se excite a otro estado de energía más alta. Los estados triplete duran mucho más que los estados singlete, y para evitar que los estados triplete se exciten, el tiempo entre pulsos láser debe ser lo suficientemente largo para permitir que el electrón se relaje a través de otro método de extinción, o se debe agregar un compuesto químico para extinguir el estado triplete. ^{[20] [42] [43]}

Véase también

• Microscopía confocal
• Fluorescencia
• Microscopio de fluorescencia
• Microscopía de agotamiento del estado fundamental
• Microscopía confocal de barrido láser
• Microscopio óptico
• Microscopía de localización fotoactivada
• Microscopía de reconstrucción óptica estocástica
• Microscopía de superresolución

Referencias

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Enlaces externos

• Visión general del Departamento de NanoBiofotónica del Instituto Max Planck de Química Biofísica .
• Breve resumen de las ecuaciones RESOLFT desarrolladas por Stefan Hell .
• Conferencia de Stefan Hell: Superresolución: descripción general y microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED)
• Microscopía óptica: una revolución contemporánea en curso (Revisión introductoria)