La síntesis artificial de genes , o simplemente síntesis génica , se refiere a un grupo de métodos que se utilizan en biología sintética para construir y ensamblar genes a partir de nucleótidos de novo . A diferencia de la síntesis de ADN en células vivas, la síntesis artificial de genes no requiere ADN molde, lo que permite sintetizar prácticamente cualquier secuencia de ADN en el laboratorio. Comprende dos pasos principales, el primero de los cuales es la síntesis de ADN en fase sólida , a veces conocida como impresión de ADN . [1] Esto produce fragmentos de oligonucleótidos que generalmente tienen menos de 200 pares de bases. El segundo paso implica conectar estos fragmentos de oligonucleótidos utilizando varios métodos de ensamblaje de ADN. Debido a que la síntesis artificial de genes no requiere ADN molde, teóricamente es posible hacer una molécula de ADN completamente sintética sin límites en la secuencia de nucleótidos o el tamaño.
La síntesis del primer gen completo, un ARNt de levadura , fue demostrada por Har Gobind Khorana y colaboradores en 1972. [2] La síntesis de los primeros genes codificadores de péptidos y proteínas se realizó en los laboratorios de Herbert Boyer y Alexander Markham , respectivamente. [3] [4] Más recientemente, se han desarrollado métodos de síntesis de genes artificiales que permitirán el ensamblaje de cromosomas y genomas completos. El primer cromosoma sintético de levadura se sintetizó en 2014, y también se han sintetizado cromosomas bacterianos funcionales completos. [5] Además, la síntesis de genes artificiales podría en el futuro hacer uso de nuevos pares de nucleobases (pares de bases no naturales). [6] [7] [8]
Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando bloques de construcción llamados fosforamiditas de nucleósidos . Estos pueden ser nucleósidos normales o modificados que tienen grupos protectores para evitar que sus aminas, grupos hidroxilo y grupos fosfato interactúen incorrectamente. Se agrega una fosforamidita a la vez, se desprotege el grupo hidroxilo 5' y se agrega una nueva base, y así sucesivamente. La cadena crece en la dirección 3' a 5', que es hacia atrás en relación con la biosíntesis. Al final, se eliminan todos los grupos protectores. Sin embargo, al ser un proceso químico, ocurren varias interacciones incorrectas que dan lugar a algunos productos defectuosos. Cuanto más larga sea la secuencia de oligonucleótidos que se está sintetizando, más defectos hay, por lo que este proceso solo es práctico para producir secuencias cortas de nucleótidos . El límite práctico actual es de aproximadamente 200 pb ( pares de bases ) para un oligonucleótido con calidad suficiente para ser utilizado directamente para una aplicación biológica. La HPLC se puede utilizar para aislar productos con la secuencia adecuada. Mientras tanto, se puede sintetizar una gran cantidad de oligos en paralelo en chips genéticos . Para obtener un rendimiento óptimo en los procedimientos de síntesis genética posteriores, se deben preparar individualmente y en escalas mayores.
Por lo general, se crea un conjunto de oligonucleótidos diseñados individualmente en sintetizadores automatizados en fase sólida, se purifican y luego se conectan mediante hibridación específica y reacciones de ligadura estándar o polimerasa . Para mejorar la especificidad de la hibridación de oligonucleótidos, el paso de síntesis se basa en un conjunto de enzimas polimerasa y ligasa de ADN termoestables . Hasta la fecha, se han descrito varios métodos para la síntesis de genes, como la ligadura de oligonucleótidos superpuestos fosforilados, [2] [3] el método Fok I [4] y una forma modificada de reacción en cadena de la ligasa para la síntesis de genes. Además, se han descrito varios enfoques de ensamblaje de PCR . [9] Por lo general, emplean oligonucleótidos de 40-50 nucleótidos de longitud que se superponen entre sí. Estos oligonucleótidos están diseñados para cubrir la mayor parte de la secuencia de ambas hebras, y la molécula de longitud completa se genera progresivamente mediante PCR de extensión de superposición (OE), [9] PCR de adentro hacia afuera equilibrada termodinámicamente (TBIO) [10] o enfoques combinados. [11] Los genes sintetizados con mayor frecuencia tienen un tamaño que va desde los 600 a los 1.200 pb, aunque se han creado genes mucho más largos mediante la unión de fragmentos previamente ensamblados de menos de 1.000 pb. En este rango de tamaño es necesario probar varios clones candidatos que confirmen la secuencia del gen sintético clonado mediante métodos de secuenciación automática.
Además, debido a que el ensamblaje del producto génico de longitud completa depende de la alineación eficiente y específica de oligonucleótidos monocatenarios largos, los parámetros críticos para el éxito de la síntesis incluyen regiones de secuencia extendida que comprenden estructuras secundarias causadas por repeticiones invertidas, contenido de GC extraordinariamente alto o bajo o estructuras repetitivas. Por lo general, estos segmentos de un gen particular solo se pueden sintetizar dividiendo el procedimiento en varios pasos consecutivos y un ensamblaje final de subsecuencias más cortas, lo que a su vez conduce a un aumento significativo en el tiempo y la mano de obra necesarios para su producción. El resultado de un experimento de síntesis génica depende en gran medida de la calidad de los oligonucleótidos utilizados. Para estos protocolos de síntesis génica basados en el recocido, la calidad del producto depende directa y exponencialmente de la exactitud de los oligonucleótidos empleados. Alternativamente, después de realizar la síntesis génica con oligos de menor calidad, se debe hacer un mayor esfuerzo en el control de calidad posterior durante el análisis de clones, que generalmente se realiza mediante procedimientos de clonación y secuenciación estándar que consumen mucho tiempo. Otro problema asociado con todos los métodos actuales de síntesis de genes es la alta frecuencia de errores de secuencia debido al uso de oligonucleótidos sintetizados químicamente. La frecuencia de error aumenta con oligonucleótidos más largos y, como consecuencia, el porcentaje de producto correcto disminuye drásticamente a medida que se utilizan más oligonucleótidos. El problema de la mutación podría resolverse utilizando oligonucleótidos más cortos para ensamblar el gen. Sin embargo, todos los métodos de ensamblaje basados en el annealing requieren que los cebadores se mezclen juntos en un tubo. En este caso, las superposiciones más cortas no siempre permiten el annealing preciso y específico de cebadores complementarios, lo que da como resultado la inhibición de la formación del producto de longitud completa. El diseño manual de oligonucleótidos es un procedimiento laborioso y no garantiza la síntesis exitosa del gen deseado. Para un rendimiento óptimo de casi todos los métodos basados en el annealing, se supone que las temperaturas de fusión de las regiones superpuestas son similares para todos los oligonucleótidos. La optimización necesaria de los cebadores debe realizarse utilizando programas de diseño de oligonucleótidos especializados. Hasta ahora se han presentado varias soluciones para el diseño automatizado de cebadores para la síntesis de genes. [12] [13] [14]
Para superar los problemas asociados con la calidad de los oligonucleótidos se han desarrollado varias estrategias elaboradas, empleando oligonucleótidos de pesca preparados por separado, [15] enzimas de unión de desajustes de la familia mutS [16] o endonucleasas específicas de bacterias o fagos. [17] Sin embargo, todas estas estrategias aumentan el tiempo y los costos de la síntesis de genes basada en el recocido de oligonucleótidos sintetizados químicamente.
La secuenciación masiva paralela también se ha utilizado como herramienta para examinar bibliotecas de oligonucleótidos complejos y permitir la recuperación de moléculas precisas. En un enfoque, los oligonucleótidos se secuencian en la plataforma de pirosecuenciación 454 y un sistema robótico toma imágenes y selecciona perlas individuales correspondientes a la secuencia precisa. [18] En otro enfoque, una biblioteca compleja de oligonucleótidos se modifica con etiquetas flanqueantes únicas antes de la secuenciación masiva paralela. Los cebadores dirigidos por etiquetas permiten luego la recuperación de moléculas con secuencias deseadas mediante PCR de marcación. [19]
Cada vez más, los genes se ordenan en conjuntos que incluyen genes funcionalmente relacionados o múltiples variantes de secuencia en un solo gen. Prácticamente todas las proteínas terapéuticas en desarrollo, como los anticuerpos monoclonales, se optimizan probando muchas variantes genéticas para mejorar su función o expresión.
Mientras que la síntesis tradicional de ácidos nucleicos sólo utiliza cuatro pares de bases (adenina, timina, guanina y citosina), en el futuro la síntesis de oligonucleótidos podría incorporar el uso de pares de bases no naturales, que son nucleobases diseñadas y sintetizadas artificialmente que no existen en la naturaleza.
En 2012, un grupo de científicos estadounidenses dirigido por Floyd Romesberg, un biólogo químico del Scripps Research Institute en San Diego, California, publicó que su equipo diseñó un par de bases no naturales (UBP). Los dos nuevos nucleótidos artificiales o pares de bases no naturales (UBP) se denominaron d5SICS y dNaM . Más técnicamente, estos nucleótidos artificiales que llevan nucleobases hidrofóbicas , presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS–dNaM) o par de bases en el ADN. En 2014, el mismo equipo del Scripps Research Institute informó que sintetizaron un tramo de ADN circular conocido como plásmido que contiene pares de bases naturales TA y CG junto con el UBP de mejor rendimiento que había diseñado el laboratorio de Romesberg, y lo insertaron en células de la bacteria común E. coli que replicó con éxito los pares de bases no naturales a lo largo de múltiples generaciones. Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético expandido a las generaciones posteriores. Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de alga de apoyo que expresa un transportador de trifosfato de nucleótidos que importa de manera eficiente los trifosfatos de d5SICSTP y dNaMTP a las bacterias E. coli . Luego, las vías de replicación bacterianas naturales los utilizan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS–dNaM.
La incorporación exitosa de un tercer par de bases es un avance significativo hacia el objetivo de expandir en gran medida el número de aminoácidos que pueden ser codificados por el ADN, de los 20 aminoácidos existentes a 172 teóricamente posibles, expandiendo así el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas . [20] En el futuro, estos pares de bases no naturales podrían sintetizarse e incorporarse a oligonucleótidos a través de métodos de impresión de ADN.
La impresión de ADN puede utilizarse para producir partes de ADN, que se definen como secuencias de ADN que codifican una función biológica específica (por ejemplo, promotores , secuencias reguladoras de la transcripción o marcos de lectura abiertos ). [21] Sin embargo, debido a que la síntesis de oligonucleótidos normalmente no puede producir con precisión secuencias de oligonucleótidos más largas que unos pocos cientos de pares de bases, se deben emplear métodos de ensamblaje de ADN para ensamblar estas partes para crear genes funcionales, circuitos multigénicos o incluso cromosomas o genomas sintéticos completos. Algunas técnicas de ensamblaje de ADN solo definen protocolos para unir partes de ADN, mientras que otras técnicas también definen las reglas para el formato de las partes de ADN que son compatibles con ellas. Estos procesos se pueden ampliar para permitir el ensamblaje de cromosomas o genomas completos. En los últimos años, ha habido una proliferación en el número de diferentes estándares de ensamblaje de ADN con 14 estándares de ensamblaje diferentes desarrollados a partir de 2015, cada uno con sus pros y sus contras. [22] En general, el desarrollo de estándares de ensamblaje de ADN ha facilitado enormemente el flujo de trabajo de la biología sintética, ha ayudado al intercambio de material entre grupos de investigación y también ha permitido la creación de partes de ADN modulares y reutilizables. [22]
Los diversos métodos de ensamblaje de ADN se pueden clasificar en tres categorías principales: ensamblaje mediado por endonucleasas, recombinación específica del sitio y ensamblaje basado en superposición prolongada. [22] Cada grupo de métodos tiene sus características distintivas y sus propias ventajas y limitaciones.
Las endonucleasas son enzimas que reconocen y escinden segmentos de ácidos nucleicos y pueden utilizarse para dirigir el ensamblaje del ADN. De los diferentes tipos de enzimas de restricción, las enzimas de restricción de tipo II son las más comúnmente disponibles y utilizadas porque sus sitios de escisión se encuentran cerca o en sus sitios de reconocimiento. Por lo tanto, los métodos de ensamblaje mediados por endonucleasas hacen uso de esta propiedad para definir partes del ADN y protocolos de ensamblaje.
El estándar de ensamblaje BioBricks fue descrito e introducido por Tom Knight en 2003 y se ha actualizado constantemente desde entonces. [23] Actualmente, el estándar BioBricks más utilizado es el estándar de ensamblaje 10, o BBF RFC 10. BioBricks define las secuencias de prefijo y sufijo necesarias para que una parte de ADN sea compatible con el método de ensamblaje BioBricks, lo que permite la unión de todas las partes de ADN que están en el formato BioBricks.
El prefijo contiene los sitios de restricción para EcoRI, NotI y XBaI, mientras que el sufijo contiene los sitios de restricción SpeI, NotI y PstI. Fuera de las regiones de prefijo y sufijo, la parte de ADN no debe contener estos sitios de restricción. Para unir dos partes de BioBrick, uno de los plásmidos se digiere con EcoRI y SpeI mientras que el segundo plásmido se digiere con EcoRI y XbaI. Los dos salientes de EcoRI son complementarios y, por lo tanto, se unirán, mientras que SpeI y XbaI también producen salientes complementarios que también se pueden ligar entre sí. Como el plásmido resultante contiene las secuencias de prefijo y sufijo originales, se puede utilizar para unir más partes de BioBricks. [24] Debido a esta propiedad, se dice que el estándar de ensamblaje de BioBricks es idempotente por naturaleza. Sin embargo, también habrá una secuencia de "cicatriz" (ya sea TACTAG o TACTAGAG) formada entre los dos BioBricks fusionados. Esto evita que BioBricks se utilice para crear proteínas de fusión, ya que la secuencia de cicatriz de 6 pb codifica una tirosina y un codón de terminación, lo que hace que la traducción finalice después de que se exprese el primer dominio, mientras que la secuencia de cicatriz de 8 pb causa un cambio de marco de lectura , lo que evita la lectura continua de los codones. Para ofrecer secuencias de cicatriz alternativas que, por ejemplo, den una cicatriz de 6 pb, o secuencias de cicatriz que no contengan codones de terminación, se diseñaron otros estándares de ensamblaje como el ensamblaje BB-2, el ensamblaje BglBricks, el ensamblaje Silver y el ensamblaje Freiburg. [25] [26] [27] [28]
Si bien el método más sencillo para ensamblar las piezas de BioBrick se describe anteriormente, también existen otros métodos de ensamblaje de uso común que ofrecen varias ventajas sobre el ensamblaje estándar. El ensamblaje de 3 antibióticos (3A) permite seleccionar el ensamblaje correcto mediante la selección de antibióticos, mientras que el ensamblaje de inserto amplificado busca superar la baja eficiencia de transformación observada en el ensamblaje 3A. [29] [30]
El estándar de ensamblaje BioBrick también ha servido como inspiración para el uso de otros tipos de endonucleasas para el ensamblaje de ADN. Por ejemplo, tanto el estándar iBrick como los estándares de ensamblaje de vectores HomeRun emplean endonucleasas homing en lugar de enzimas de restricción de tipo II. [31] [32]
Algunos métodos de ensamblaje también utilizan endonucleasas de restricción de tipo II. Estas se diferencian de otras endonucleasas de tipo II en que cortan varios pares de bases del sitio de reconocimiento. Como resultado, la secuencia saliente se puede modificar para que contenga la secuencia deseada. Esto proporciona a los métodos de ensamblaje de tipo II dos ventajas: permite un ensamblaje "sin cicatrices" y permite un ensamblaje de varias partes en un solo paso. Los métodos de ensamblaje que utilizan endonucleasas de tipo II incluyen Golden Gate y sus variantes asociadas.
El protocolo de ensamblaje Golden Gate fue definido por Engler et al. 2008 para definir un método de ensamblaje de ADN que daría como resultado una construcción final sin una secuencia de cicatriz, pero sin los sitios de restricción originales. Esto permite que la proteína se exprese sin contener secuencias proteicas no deseadas que podrían afectar negativamente el plegamiento o la expresión de la proteína. Al utilizar la enzima de restricción BsaI que produce un saliente de 4 pares de bases, se pueden utilizar hasta 240 secuencias únicas, no palindrómicas, para el ensamblaje. [33]
Diseño y ensamblaje de plásmidos
En la clonación Golden Gate, cada fragmento de ADN que se va a ensamblar se coloca en un plásmido, flanqueado por sitios de restricción BsaI orientados hacia adentro que contienen las secuencias salientes programadas. Para cada fragmento de ADN, la secuencia saliente 3' es complementaria a la saliente 5' del siguiente fragmento de ADN aguas abajo. Para el primer fragmento, la saliente 5' es complementaria a la saliente 5' del plásmido de destino, mientras que la saliente 3' del fragmento final es complementaria a la saliente 3' del plásmido de destino. Este diseño permite que todos los fragmentos de ADN se ensamblen en una reacción de un solo recipiente (donde todos los reactivos se mezclan juntos), con todos los fragmentos dispuestos en la secuencia correcta. Las construcciones ensambladas con éxito se seleccionan detectando la pérdida de función de un casete de detección que originalmente estaba en el plásmido de destino. [33]
MoClo y trenza dorada
El ensamblaje Golden Gate original solo permite la creación de un único constructo en el vector de destino. Para permitir que este constructo se utilice en una reacción posterior como vector de entrada, se diseñaron los estándares MoClo y Golden Braid. [34]
El estándar MoClo implica definir múltiples niveles de ensamblaje de ADN:
Cada nivel de ensamblaje alterna el uso de los sitios de restricción BsaI y BpiI para minimizar el número de sitios prohibidos, y el ensamblaje secuencial para cada nivel se logra siguiendo el diseño del plásmido Golden Gate. En general, el estándar MoClo permite el ensamblaje de un constructo que contiene múltiples unidades de transcripción, todas ensambladas a partir de diferentes partes de ADN, mediante una serie de reacciones Golden Gate en un solo recipiente. Sin embargo, un inconveniente del estándar MoClo es que requiere el uso de "partes ficticias" sin función biológica, si el constructo final requiere menos de cuatro partes componentes. [35] El estándar Golden Braid, por otro lado, introdujo un estándar de ensamblaje Golden Gate por pares.
El estándar Golden Braid utiliza el mismo ensamblaje por niveles que MoClo, pero cada nivel solo implica el ensamblaje de dos fragmentos de ADN, es decir, un enfoque por pares. Por lo tanto, en cada nivel, se clonan pares de genes en un fragmento de destino en la secuencia deseada, y estos se ensamblan posteriormente de dos en dos en niveles sucesivos. Al igual que MoClo, el estándar Golden Braid alterna las enzimas de restricción BsaI y BpiI entre cada nivel.
El desarrollo de los métodos de ensamblaje Golden Gate y sus variantes ha permitido a los investigadores diseñar kits de herramientas para acelerar el flujo de trabajo de la biología sintética. Por ejemplo, EcoFlex se desarrolló como un kit de herramientas para E. Coli que utiliza el estándar MoClo para sus partes de ADN, mientras que también se desarrolló un kit de herramientas similar para la ingeniería de la microalga Chlamydomonas reinhardtii . [36] [37]
La recombinación específica de sitio utiliza integrasas de fagos en lugar de enzimas de restricción, eliminando la necesidad de tener sitios de restricción en los fragmentos de ADN. En cambio, las integrasas utilizan sitios de unión únicos (att) y catalizan la reorganización del ADN entre el fragmento objetivo y el vector de destino. El sistema de clonación Invitrogen Gateway se inventó a fines de la década de 1990 y utiliza dos mezclas de enzimas patentadas, la clonasa BP y la clonasa LR. La mezcla de clonasa BP cataliza la recombinación entre los sitios attB y attP, generando sitios híbridos attL y attR, mientras que la mezcla de clonasa LR cataliza la recombinación de los sitios attL y attR para dar sitios attB y attP. Como cada mezcla de enzimas reconoce solo sitios att específicos, la recombinación es altamente específica y los fragmentos se pueden ensamblar en la secuencia deseada. [38]
Diseño y montaje vectorial
Dado que la clonación Gateway es una tecnología patentada, todas las reacciones Gateway deben llevarse a cabo con el kit Gateway proporcionado por el fabricante. La reacción se puede resumir en dos pasos. El primer paso implica ensamblar los clones de entrada que contienen el fragmento de ADN de interés, mientras que el segundo paso implica insertar este fragmento de interés en el clon de destino.
Las primeras iteraciones del método de clonación Gateway solo permitían utilizar un clon de entrada por cada clon de destino producido. Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que se podían generar cuatro secuencias att más ortogonales, lo que permitía ensamblar hasta cuatro fragmentos de ADN diferentes, y este proceso ahora se conoce como tecnología Multisite Gateway. [39]
Además de la clonación Gateway, también se han desarrollado métodos no comerciales que utilizan otras integrasas. Por ejemplo, el método de ensamblaje recombinante de la serina integrasa (SIRA) utiliza la integrasa ϕC31, mientras que el método de ensamblaje en tándem basado en la recombinación específica del sitio (SSRTA) utiliza la integrasa φBT1 del fago Streptomyces . [40] [41] Otros métodos, como el sistema de ensamblaje de vectores HomeRun (HVAS), se basan en el sistema de clonación Gateway y, además, incorporan endonucleasas homing para diseñar un protocolo que podría respaldar la síntesis industrial de construcciones de ADN sintético. [31]
En los últimos años se han desarrollado diversos métodos de ensamblaje basados en superposiciones prolongadas. Uno de los métodos más utilizados, el método de ensamblaje de Gibson, se desarrolló en 2009 y proporciona un método de ensamblaje de ADN en un solo paso que no requiere el uso de enzimas de restricción o integrasas. [42] Otros métodos de ensamblaje basados en superposiciones similares incluyen la clonación por extensión de polimerasa circular (CPEC), la clonación independiente de secuencia y ligasa (SLIC) y la extracción de clonación por ligación sin fisuras (SLiCE). [43] [44] [45] A pesar de la presencia de muchos métodos de ensamblaje por superposición, el método de ensamblaje de Gibson sigue siendo el más popular. [46] Además de los métodos enumerados anteriormente, otros investigadores se han basado en los conceptos utilizados en el ensamblaje de Gibson y otros métodos de ensamblaje para desarrollar nuevas estrategias de ensamblaje como la estrategia de ensamblaje dirigido por superposición modular con enlazadores (MODAL) o el método estándar de ensamblaje Biopart para clonación idempotente (BASIC). [47] [48]
El método de ensamblaje de Gibson es un método de ensamblaje de ADN relativamente sencillo, que requiere solo unos pocos reactivos adicionales: la exonucleasa 5' T5 , la ADN polimerasa Phusion y la ADN ligasa Taq . Los fragmentos de ADN que se van a ensamblar se sintetizan para que tengan los extremos 5' y 3' superpuestos en el orden en que se van a ensamblar. Estos reactivos se mezclan junto con los fragmentos de ADN que se van a ensamblar a 50 °C y ocurren las siguientes reacciones:
Debido a que la exonucleasa T5 es termolábil, se inactiva a 50 °C después del paso inicial de masticación. El producto es, por lo tanto, estable y los fragmentos se ensamblan en el orden deseado. Este protocolo de un solo paso puede ensamblar con precisión hasta 5 fragmentos diferentes, mientras que varios proveedores comerciales tienen kits para ensamblar con precisión hasta 15 fragmentos diferentes en una reacción de dos pasos. [49] Sin embargo, si bien el protocolo de ensamblaje de Gibson es rápido y utiliza relativamente pocos reactivos, requiere una síntesis de ADN a medida, ya que cada fragmento debe diseñarse para que contenga secuencias superpuestas con los fragmentos adyacentes y amplificarse mediante PCR. Esta dependencia de la PCR también puede afectar la fidelidad de la reacción cuando se utilizan fragmentos largos, fragmentos con alto contenido de GC o secuencias repetidas. [48]
La estrategia MODAL define secuencias superpuestas conocidas como "enlazadores" para reducir la cantidad de personalización que se debe realizar con cada fragmento de ADN. Los enlazadores se diseñaron utilizando el software R2oDNA Designer y las regiones superpuestas se diseñaron para que tuvieran una longitud de 45 pb para que fueran compatibles con el ensamblaje de Gibson y otros métodos de ensamblaje por superposición. Para unir estos enlazadores a las partes que se van a ensamblar, se realiza una PCR utilizando cebadores específicos de la parte que contienen secuencias adaptadoras de prefijo y sufijo de 15 pb. A continuación, los enlazadores se unen a las secuencias adaptadoras mediante una segunda reacción de PCR. Para posicionar los fragmentos de ADN, se unirá el mismo enlazador al sufijo del fragmento aguas arriba deseado y al prefijo de los fragmentos aguas abajo deseados. Una vez unidos los enlazadores, se pueden utilizar el ensamblaje de Gibson, CPEC u otros métodos de ensamblaje por superposición para ensamblar los fragmentos de ADN en el orden deseado.
La estrategia de ensamblaje BASIC se desarrolló en 2015 y buscó abordar las limitaciones de las técnicas de ensamblaje anteriores, incorporando seis conceptos clave de ellas: partes reutilizables estándar; formato de un solo nivel (todas las partes tienen el mismo formato y se ensamblan utilizando el mismo proceso); clonación idempotente; ensamblaje de ADN paralelo (multiparte); independencia de tamaño; automatizabilidad. [48]
Diseño de enlaces y partes del ADN
Las partes de ADN se diseñan y clonan en plásmidos de almacenamiento, con la parte flanqueada por un prefijo integrado ( i P) y una secuencia de sufijo integrada ( i S). Las secuencias i P e i S contienen sitios de restricción BsaI orientados hacia adentro, que contienen salientes complementarios a los enlazadores BASIC. [48] Al igual que en MODAL, los 7 enlazadores estándar utilizados en BASIC se diseñaron con el software R2oDNA Designer y se examinaron para garantizar que no contienen secuencias con homología con genomas de chasis y que no contienen secuencias no deseadas como secuencias de estructura secundaria, sitios de restricción o sitios de unión ribosomal. Cada secuencia enlazadora se divide en dos mitades, cada una con un saliente de 4 pb complementario al sitio de restricción BsaI, una secuencia bicatenaria de 12 pb y que comparte una secuencia de superposición de 21 pb con la otra mitad. La mitad que se une a la parte de ADN anterior se conoce como la parte de enlace de sufijo (por ejemplo, L1S) y la mitad que se une a la parte posterior se conoce como la parte de enlace de prefijo (por ejemplo, L1P). Estos enlaces forman la base para ensamblar las partes de ADN.
Además de dirigir el orden de ensamblaje, los conectores BASIC estándar también pueden modificarse para realizar otras funciones. Para permitir un ensamblaje idempotente, también se diseñaron conectores con secuencias i P e i S metiladas adicionales insertadas para protegerlas de ser reconocidas por BsaI. Esta metilación se pierde después de la transformación y la replicación in vivo del plásmido, y los plásmidos pueden extraerse, purificarse y usarse para reacciones posteriores.
Debido a que la secuencia de enlace es relativamente larga (45 pb para un enlace estándar), existe la oportunidad de incorporar secuencias de ADN funcionales para reducir la cantidad de partes de ADN necesarias durante el ensamblaje. El estándar de ensamblaje BASIC proporciona varios enlaces integrados con RBS de diferentes fortalezas. De manera similar, para facilitar la construcción de proteínas de fusión que contienen múltiples dominios proteicos, también se diseñaron varios enlaces de fusión para permitir la lectura completa de la construcción de ADN. Estos enlaces de fusión codifican un polipéptido de glicina y serina de 15 aminoácidos, que es un péptido de enlace ideal para proteínas de fusión con múltiples dominios.
Asamblea
Hay tres pasos principales en el montaje del constructo final.
Como los métodos de impresión y ensamblaje de ADN han permitido que la síntesis genética comercial se vuelva progresiva y exponencialmente más barata en los últimos años, [50] la síntesis genética artificial representa una herramienta de ingeniería poderosa y flexible para crear y diseñar nuevas secuencias de ADN y funciones proteínicas. Además de la biología sintética, varias áreas de investigación como las que involucran la expresión genética heteróloga , el desarrollo de vacunas , la terapia génica y la ingeniería molecular, se beneficiarían enormemente de tener métodos rápidos y baratos para sintetizar ADN para codificar proteínas y péptidos. [51] Los métodos utilizados para la impresión y ensamblaje de ADN incluso han permitido el uso del ADN como medio de almacenamiento de información .
El 28 de junio de 2007, un equipo del Instituto J. Craig Venter publicó un artículo en Science Express , diciendo que habían trasplantado con éxito el ADN natural de una bacteria Mycoplasma mycoides a una célula de Mycoplasma capricolum , creando una bacteria que se comportaba como un M. mycoides . [52]
El 6 de octubre de 2007, Craig Venter anunció en una entrevista con el periódico británico The Guardian que el mismo equipo había sintetizado artificialmente una versión modificada del cromosoma único de Mycoplasma genitalium . El cromosoma fue modificado para eliminar todos los genes que las pruebas en bacterias vivas habían demostrado que eran innecesarios. El siguiente paso planeado en este proyecto de genoma mínimo es trasplantar el genoma mínimo sintetizado en una célula bacteriana con su ADN antiguo eliminado; la bacteria resultante se llamará Mycoplasma laboratorium . Al día siguiente, el grupo de bioética canadiense , ETC Group, emitió una declaración a través de su representante, Pat Mooney , diciendo que la "creación" de Venter era "un chasis sobre el que se podría construir casi cualquier cosa". El genoma sintetizado aún no había sido trasplantado a una célula funcional. [53]
El 21 de mayo de 2010, Science informó que el grupo de Venter había sintetizado con éxito el genoma de la bacteria Mycoplasma mycoides a partir de un registro informático y había trasplantado el genoma sintetizado a la célula existente de una bacteria Mycoplasma capricolum a la que se le había eliminado el ADN. La bacteria "sintética" era viable, es decir, capaz de replicarse miles de millones de veces. El equipo había planeado originalmente utilizar la bacteria M. genitalium con la que habían estado trabajando anteriormente, pero cambió a M. mycoides porque esta última bacteria crece mucho más rápido, lo que se tradujo en experimentos más rápidos. [54] Venter la describe como "la primera especie... cuyos padres son una computadora". [55] La bacteria transformada es bautizada " Synthia " por ETC. Un portavoz de Venter se ha negado a confirmar cualquier avance en el momento de escribir este artículo.
Como parte del proyecto Synthetic Yeast 2.0, varios grupos de investigación de todo el mundo han participado en un proyecto para sintetizar genomas de levadura sintética y, a través de este proceso, optimizar el genoma del organismo modelo Saccharomyces cerevisiae . [56] El proyecto Yeast 2.0 aplicó varios métodos de ensamblaje de ADN que se han discutido anteriormente, y en marzo de 2014, Jef Boeke del Langone Medical Centre de la Universidad de Nueva York, reveló que su equipo había sintetizado el cromosoma III de S. cerevisiae . [57] [58] El procedimiento implicó reemplazar los genes en el cromosoma original con versiones sintéticas y luego el cromosoma sintético terminado se integró en una célula de levadura. Requirió diseñar y crear 273.871 pares de bases de ADN, menos que los 316.667 pares en el cromosoma original. En marzo de 2017, se había completado la síntesis de 6 de los 16 cromosomas, y la síntesis de los otros aún estaba en curso. [59]
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