DRIP-seq (DRIP-secuenciación) es una tecnología para el perfilado de todo el genoma de un tipo de híbrido de ADN-ARN llamado " bucle R ". [1] DRIP-seq utiliza un anticuerpo independiente de la secuencia pero específico de la estructura para la inmunoprecipitación de ADN-ARN (DRIP) para capturar bucles R para la secuenciación masiva de ADN en paralelo . [1]
Un R-loop es una estructura de ácido nucleico de tres cadenas , que consta de un dúplex híbrido de ADN-ARN y un ADN monocatenario desplazado (ssDNA). [2] Los R-loops se forman predominantemente en regiones genómicas ricas en citosina durante la transcripción [2] y se sabe que están involucrados en la expresión génica y el cambio de clase de inmunoglobulina . [1] [3] [4] Se han encontrado en una variedad de especies, que van desde bacterias hasta mamíferos. [2] Se localizan preferentemente en promotores de islas CpG en células humanas y regiones altamente transcritas en levadura. [1] [3]
En condiciones anormales, concretamente una producción elevada de híbridos ADN-ARN, los R-loops pueden provocar inestabilidad genómica al exponer el ADN monocatenario a daños endógenos ejercidos por la acción de enzimas como AID y APOBEC , o la sobreexposición a especies químicamente reactivas. [4] Por lo tanto, comprender dónde y en qué circunstancias se forman los R-loops en el genoma es crucial para comprender mejor la inestabilidad genómica. La caracterización de los R-loops se limitaba inicialmente a enfoques específicos de locus. [5] Sin embargo, con la llegada de tecnologías de secuenciación paralela masiva y, posteriormente, derivados como DRIP-seq, se ha abierto la posibilidad de investigar genomas enteros en busca de R-loops.
DRIP-seq se basa en la alta especificidad y afinidad del anticuerpo monoclonal (mAb) S9.6 hacia híbridos de ADN-ARN de varias longitudes. El mAb S9.6 se creó y caracterizó por primera vez en 1986 y actualmente se utiliza para la inmunoprecipitación selectiva de bucles R. [6] Desde entonces, se ha utilizado en diversos métodos de inmunoprecipitación para la caracterización de bucles R. [1] [3] [7] [8] El concepto detrás de DRIP-seq es similar a la secuenciación de ChIP ; los fragmentos de bucles R son el principal material inmunoprecipitado en DRIP-seq.
La técnica DRIP-seq se utiliza principalmente para el mapeo de bucles R en todo el genoma. La identificación de los sitios de formación de bucles R permite el estudio de diversos eventos celulares, como la función de la formación de bucles R en regiones específicas, la caracterización de estas regiones y el impacto en la expresión génica. También se puede utilizar para estudiar la influencia de los bucles R en otros procesos como la replicación y la síntesis de ADN. De manera indirecta, la técnica DRIP-seq se puede realizar en líneas celulares mutantes deficientes en genes involucrados en la resolución de bucles R. [3] Este tipo de estudios proporciona información sobre las funciones del gen mutado en la supresión de la formación de ADN-ARN y, potencialmente, sobre la importancia de los bucles R en la inestabilidad del genoma.
DRIP-seq se utilizó por primera vez para el perfil de todo el genoma de bucles R en humanos, lo que mostró una formación generalizada de bucles R en los promotores de las islas CpG. [1] En particular, los investigadores descubrieron que la formación de bucles R está asociada con el estado no metilado de las islas CpG.
Posteriormente, se utilizó DRIP-seq para perfilar la formación de bucles R en los sitios de inicio y terminación de la transcripción en células Ntera2 pluripotentes humanas . [7] En este estudio, los investigadores revelaron que los bucles R en los extremos 3' de los genes pueden estar correlacionados con la terminación de la transcripción.
En primer lugar, se extrae el ADN genómico (gDNA) de las células de interés mediante un tratamiento con proteinasa K, seguido de una extracción con fenol-cloroformo y una precipitación con etanol . Es necesaria una digestión adicional con zimoliasa para que las células de levadura eliminen la pared celular antes del tratamiento con proteinasa K. El gDNA también se puede extraer con una variedad de otros métodos, como los métodos basados en columnas .
El ADN genómico se trata con la nucleasa S1 para eliminar el ADN monocatenario y el ARN no deseados , seguido de una precipitación con etanol para eliminar la nucleasa S1. Luego, el ADN genómico se fragmenta con una endonucleasa de restricción , lo que produce fragmentos de ADN bicatenario (dsADN) de diferentes tamaños. Alternativamente, los fragmentos de ADN genómico se pueden generar mediante sonicación .
El ADN genómico fragmentado se incuba con el mAb S9.6 específico para la estructura del ADN-ARN. Este paso es exclusivo del protocolo DRIP-seq, ya que depende completamente de la alta especificidad y afinidad del mAb S9.6 para los híbridos de ADN-ARN. El anticuerpo reconocerá y se unirá a estas regiones dispersas por todo el genoma y se utilizará para la inmunoprecipitación. Los anticuerpos S9.6 se unen a las perlas magnéticas al interactuar con ligandos específicos (es decir, proteína A o proteína G ) en la superficie de las perlas. Por lo tanto, los fragmentos que contienen ADN-ARN se unirán a las perlas por medio del anticuerpo.
Las perlas magnéticas se lavan para eliminar cualquier ADN genómico no unido a las perlas mediante una serie de lavados y los híbridos ADN-ARN se recuperan por elución. Para eliminar el anticuerpo unido a los híbridos de ácidos nucleicos, se realiza un tratamiento con proteinasa K seguido de una extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Esto da como resultado el aislamiento de híbridos ADN-ARN purificados de diferentes tamaños.
Para la secuenciación paralela masiva de estos fragmentos, el material inmunoprecipitado se sonica, se selecciona por tamaño y se liga a adaptadores de oligonucleótidos con código de barras para el enriquecimiento del grupo y la secuenciación.
Para detectar los sitios de formación de bucles R, los cientos de millones de lecturas de secuenciación de DRIP-seq se alinean primero con un genoma de referencia con un alineador de secuencia de lectura corta , luego se pueden usar métodos de llamada de pico diseñados para ChIP-seq para evaluar las señales de DRIP. [1] Si se usaron diferentes cócteles de enzimas de restricción para diferentes experimentos de DRIP-seq de la misma muestra, se llaman picos de consenso de DRIP-seq. [7] Por lo general, los picos se comparan con los de una muestra correspondiente tratada con RNasa H1 , que sirve como control de entrada. [1] [7]
Debido a la ausencia de otro método basado en anticuerpos para la inmunoprecipitación del bucle R, la validación de los resultados de DRIP-seq es difícil. Sin embargo, los resultados de otros métodos de perfilado del bucle R, como DRIVE-seq, pueden utilizarse para medir el consenso.
Por otro lado, DRIP-seq se basa en plataformas de secuenciación de lectura corta existentes para la secuenciación de bucles R. En otras palabras, todas las limitaciones inherentes de estas plataformas también se aplican a DRIP-seq. En particular, las plataformas de secuenciación de lectura corta típicas producirían una cobertura de lectura desigual en regiones ricas en GC. La secuenciación de bucles R largos puede plantear un desafío porque los bucles R se forman predominantemente en regiones de ADN ricas en citosina. Además, las regiones ricas en GC tienden a tener una baja complejidad por naturaleza, lo que dificulta que los alineadores de lectura corta produzcan alineaciones únicas.
Aunque existen otros métodos para el análisis y la elaboración de perfiles de la formación de bucles R, [5] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] solo unos pocos proporcionan cobertura y solidez a escala del genoma. [1] [3]