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Motivo adyacente al protoespaciador

Un motivo adyacente al protoespaciador ( PAM ) es una secuencia de ADN de 2 a 6 pares de bases que sigue inmediatamente a la secuencia de ADN a la que apunta la nucleasa Cas9 en el sistema inmunológico adaptativo bacteriano CRISPR . [1] El PAM es un componente del virus o plásmido invasor, pero no se encuentra en el genoma bacteriano del huésped y, por lo tanto, no es un componente del locus CRISPR bacteriano . Cas9 no se unirá ni escindirá con éxito la secuencia de ADN objetivo si no va seguida de la secuencia PAM. [2] [3] [4] [5] PAM es un componente de direccionamiento esencial que distingue el ADN bacteriano propio del no propio, evitando así que el locus CRISPR sea atacado y destruido por la nucleasa asociada a CRISPR. [6]

Espaciadores/protoespaciadores

En un genoma bacteriano, los loci CRISPR contienen "espaciadores" (ADN viral insertado en un locus CRISPR) que en los sistemas inmunitarios adaptativos tipo II se crearon a partir de ADN viral o plásmido invasor (llamados "protoespaciadores"). Tras la invasión posterior, una nucleasa asociada a CRISPR, como Cas9, se une a un complejo tracrRNA - crRNA , que guía a Cas9 hacia la secuencia protoespaciadora invasora. Pero Cas9 no escindirá la secuencia protoespaciadora a menos que haya una secuencia PAM adyacente. El espaciador en los loci CRISPR bacterianos no contendrá una secuencia PAM y, por lo tanto, no será cortado por la nucleasa, pero el protoespaciador en el virus o plásmido invasor contendrá la secuencia PAM y, por lo tanto, será escindido por la nucleasa Cas9. [4] En aplicaciones de edición del genoma , se sintetiza un oligonucleótido corto conocido como ARN guía (ARNg) para realizar la función del complejo ARNtracr-ARNcr en el reconocimiento de secuencias de genes que tienen una secuencia PAM en el extremo 3' , "guía" de este modo. la nucleasa a una secuencia específica que la nucleasa es capaz de cortar. [7] [8]

secuencias PAM

PAM y tamaño de varias ADN nucleasas CRISPR

La PAM canónica es la secuencia 5'-NGG-3', donde "N" es cualquier nucleobase seguida de dos nucleobases de guanina ("G"). [9] Los ARN guía pueden transportar Cas9 a cualquier locus del genoma para la edición de genes, pero no se puede realizar ninguna edición en ningún sitio que no sea aquel en el que Cas9 reconoce PAM. La PAM canónica está asociada con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (denominada SpCas9), mientras que diferentes PAM están asociadas con las proteínas Cas9 de las bacterias Neisseria meningitidis , Treponema denticola y Streptococcus thermophilus . [10] 5'-NGA-3' puede ser una PAM no canónica altamente eficiente para células humanas, pero la eficiencia varía según la ubicación del genoma. [11] Se han realizado intentos de diseñar Cas9 para reconocer diferentes PAM con el fin de mejorar la capacidad de CRISPR-Cas9 para editar genes en cualquier ubicación deseada del genoma. [12]

El Cas9 de Francisella novicida reconoce la secuencia PAM canónica 5'-NGG-3', pero ha sido diseñado para reconocer 5'-YG-3' (donde "Y" es una pirimidina [13] ), lo que aumenta la gama de posibles objetivos de Cas9. [14] La nucleasa Cpf1 de Francisella novicida reconoce el PAM 5'-TTTN-3' [15] o 5'-YTN-3'. [dieciséis]

Aparte de CRISPR-Cas9 y CRISPR-Cpf1, sin duda hay muchas nucleasas y PAM aún por descubrir. [17]

CRISPR/Cas13a (anteriormente C2c2 [18] ) de la bacteria Leptotrichia shahii es un sistema CRISPR guiado por ARN que se dirige a secuencias de ARN en lugar de ADN. PAM no es relevante para un CRISPR dirigido a ARN, aunque una guanina que flanquea el objetivo afecta negativamente la eficacia y ha sido designada "sitio flanqueante de protoespaciador" (PFS). [19]

GUÍA-Seq

Se ha ideado una tecnología llamada GUIDE-Seq para analizar las escisiones fuera del objetivo producidas por dicha edición de genes. [20] El requisito de PAM se puede aprovechar para atacar específicamente mutaciones heterocigotas de un solo nucleótido sin ejercer efectos aberrantes sobre los alelos de tipo salvaje. [21]

Ver también

enlaces externos

Referencias

  1. ^ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA (2013). "Motivos de reconocimiento de protoespaciadores: identidades mixtas y diversidad funcional". Biología del ARN . 10 (5): 891–899. doi :10.4161/rna.23764. PMC  3737346 . PMID  23403393.
  2. ^ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Almendros C (2009). "Las secuencias cortas de motivos determinan los objetivos del sistema de defensa CRISPR procariótico". Microbiología . 155 (parte 3): 733–740. doi : 10.1099/mic.0.023960-0 . PMID  19246744.
  3. ^ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA (2013). "Motivos de reconocimiento de protoespaciadores: identidades mixtas y diversidad funcional". Biología del ARN . 10 (5): 891–899. doi :10.4161/rna.23764. PMC 3737346 . PMID  23403393. Archivado desde el original el 4 de septiembre de 2014. 
  4. ^ ab Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012). "Una endonucleasa de ADN programable guiada por ARN dual en inmunidad bacteriana adaptativa". Ciencia . 337 (6096): 816–821. Código Bib : 2012 Ciencia... 337..816J. doi : 10.1126/ciencia.1225829. PMC 6286148 . PMID  22745249. 
  5. ^ Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA (2014). "Interrogatorio de ADN mediante la endonucleasa Cas9 guiada por ARN CRISPR". Naturaleza . 507 (7490): 62–67. Código Bib :2014Natur.507...62S. doi : 10.1038/naturaleza13011. PMC 4106473 . PMID  24476820. 
  6. ^ Mali P, Esvelt KM, Iglesia GM (2013). "Cas9 como herramienta versátil para la ingeniería biológica". Métodos de la naturaleza . 10 (10): 957–963. doi :10.1038/nmeth.2649. PMC 4051438 . PMID  24076990. 
  7. ^ Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM (2013). "Ingeniería del genoma humano guiada por ARN mediante Cas9". Ciencia . 339 (6121): 823–826. Código Bib : 2013 Ciencia... 339..823M. doi : 10.1126/ciencia.1232033. PMC 3712628 . PMID  23287722. 
  8. ^ Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F (2013). "Ingeniería del genoma multiplex mediante sistemas CRISPR/Cas". Ciencia . 339 (6121): 819–823. Código Bib : 2013 Ciencia... 339..819C. doi :10.1126/ciencia.1231143. PMC 3795411 . PMID  23287718. 
  9. ^ Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M (2014). "Base estructural del reconocimiento del ADN diana dependiente de PAM por parte de la endonucleasa Cas9". Naturaleza . 513 (7519): 569–573. Código Bib :2014Natur.513..569A. doi : 10.1038/naturaleza13579. PMC 4176945 . PMID  25079318. 
  10. ^ Esvelt KM, Mali P, Braff JL, Moosburner M, Yaung SJ, Church GM (2013). "Proteínas Cas9 ortogonales para la regulación y edición de genes guiadas por ARN". Métodos de la naturaleza . 10 (11): 1116-1123. doi :10.1038/nmeth.2681. PMC 3844869 . PMID  24076762. 
  11. ^ Zhang Y, Ge X, Yang F, Zhang L, Zheng J, Tan X, Jin ZB, Qu J, Gu F (2014). "Comparación de PAM no canónicos para la escisión de ADN mediada por CRISPR/Cas9 en células humanas". Informes científicos . 4 : 5405. Código Bib : 2014NatSR...4E5405Z. doi :10.1038/srep05405. PMC 4066725 . PMID  24956376. 
  12. ^ Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, Gonzales AP, Li Z, Peterson RT, Yeh JR, Aryee MJ, Joung JK (2015). "Nucleasas CRISPR-Cas9 diseñadas con especificidades PAM alteradas". Naturaleza . 523 (7561): 481–485. Código Bib :2015Natur.523..481K. doi : 10.1038/naturaleza14592. PMC 4540238 . PMID  26098369. 
  13. ^ "Códigos de nucleótidos, códigos de aminoácidos y códigos genéticos". KEGG: Enciclopedia de genes y genomas de Kioto. 15 de julio de 2014 . Consultado el 6 de abril de 2016 .
  14. ^ Hirano H, Gootenberg JS, Horii T, Abudayyeh OO, Kimura M, Hsu PD, Nakane T, Ishitani R, Hatada I, Zhang F, Nishimasu H, Nureki O (2016). "Estructura e Ingeniería de Francisella novicida Cas9". Celúla . 164 (5): 950–961. doi :10.1016/j.cell.2016.01.039. PMC 4899972 . PMID  26875867. 
  15. ^ Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F (2015). "Cpf1 es una endonucleasa única guiada por ARN de un sistema CRISPR-Cas de clase 2". Celúla . 163 (3): 759–771. doi :10.1016/j.cell.2015.09.038. PMC 4638220 . PMID  26422227. 
  16. ^ Fonfara I, Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (2016). "La enzima Cpf1 que escinde el ADN asociada a CRISPR también procesa el ARN CRISPR precursor". Naturaleza . 532 (7600): 517–521. Código Bib :2016Natur.532..517F. doi : 10.1038/naturaleza17945. PMID  27096362. S2CID  2271552.
  17. ^ "Incluso CRISPR". El economista . ISSN  0013-0613 . Consultado el 27 de mayo de 2016 .
  18. ^ Shmakov S, et al. (2017). "Diversidad y evolución de los sistemas CRISPR-Cas clase 2". Nat. Rev. Microbiol. 15 (3): 169–182. doi :10.1038/nrmicro.2016.184. PMC 5851899 . PMID  28111461.  
  19. ^ Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K, Regev A, Lander ES, Koonin EV, Zhang F (2016). "C2c2 es un efector CRISPR dirigido a ARN guiado por ARN programable de un solo componente". Ciencia . 353 (6299): aaf5573. doi : 10.1126/ciencia.aaf5573. PMC 5127784 . PMID  27256883. 
  20. ^ Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, Thapar V, Wyvekens N, Khayter C, Iafrate AJ, Le LP, Aryee MJ, Joung JK (2015). "GUIDE-seq permite el perfilado de todo el genoma de la escisión fuera del objetivo mediante núcleos CRISPR-Cas". Biotecnología de la Naturaleza . 33 (2): 187–197. doi :10.1038/nbt.3117. PMC 4320685 . PMID  25513782. 
  21. ^ Li Y, Mendiratta S, Ehrhardt K, Kashyap N, White MA, Bleris L (2016). "Explotación de la restricción PAM CRISPR/Cas9 para intervenciones de resolución de un solo nucleótido". Más uno . 11 (1): e0144970. Código Bib : 2016PLoSO..1144970L. doi : 10.1371/journal.pone.0144970 . PMC 4720446 . PMID  26788852.