Un micrótomo (del griego mikros , que significa "pequeño" y temnein , que significa "cortar") es una herramienta de corte que se utiliza para producir rodajas extremadamente finas de material conocidas como secciones , denominándose el proceso microsección . Importantes en ciencia , los microtomos se utilizan en microscopía para la preparación de muestras para su observación bajo luz transmitida o radiación electrónica .
Los micrótomos utilizan hojas de acero , vidrio o diamante según la muestra que se corta y el grosor deseado de las secciones que se cortan. Las hojas de acero se utilizan para preparar secciones histológicas de tejidos animales o vegetales para microscopía óptica . Los cuchillos de vidrio se utilizan para cortar secciones para microscopía óptica y para cortar secciones muy delgadas para microscopía electrónica . Los cuchillos de diamante de calidad industrial se utilizan para cortar materiales duros como huesos , dientes y materia vegetal resistente tanto para microscopía óptica como para microscopía electrónica. Los cuchillos de diamante con calidad de gema también se utilizan para cortar secciones delgadas para microscopía electrónica.
La microtomía es un método para la preparación de secciones delgadas para materiales como huesos, minerales y dientes, y una alternativa al electropulido y la molienda de iones . Las secciones del microtomo se pueden hacer lo suficientemente delgadas como para seccionar un cabello humano a lo ancho, con un espesor de sección de entre 50 nm y 100 μm .
En los inicios del desarrollo del microscopio óptico , las secciones de plantas y animales se preparaban manualmente utilizando hojas de afeitar. Se descubrió que para observar la estructura del espécimen bajo observación era importante realizar cortes limpios y reproducibles del orden de 100 μm, a través de los cuales se puede transmitir la luz. Esto permitió la observación de muestras utilizando microscopios ópticos en modo de transmisión.
Uno de los primeros dispositivos para la preparación de tales cortes fue inventado en 1770 por George Adams, Jr. (1750-1795) y desarrollado posteriormente por Alexander Cummings . [2] El dispositivo se operaba manualmente y la muestra se sostenía en un cilindro y se creaban secciones desde la parte superior de la muestra usando una manivela. [1] [3]
En 1835, Andrew Prichard desarrolló un modelo basado en una mesa que permitía aislar la vibración fijando el dispositivo a la mesa, separando al operador del cuchillo. [4]
Ocasionalmente, se atribuye la invención del micrótomo al anatomista Wilhelm His, Sr. (1865). [5] [6] En su Beschreibung eines Mikrotoms (en alemán, descripción de un microtomo ), Wilhelm escribió:
El aparato me ha permitido una precisión en el trabajo mediante la cual puedo lograr secciones que a mano no puedo crear. Es decir, ha permitido la posibilidad de lograr secciones continuas de objetos en el curso de la investigación.
Otras fuentes atribuyen además el desarrollo al fisiólogo checo Jan Evangelista Purkyně . [7] Varias fuentes describen el modelo de Purkyne como el primero en uso práctico. [8] [9]
La oscuridad en los orígenes del microtomo se debe al hecho de que los primeros microtomos eran simplemente aparatos de corte, y la fase de desarrollo de los primeros dispositivos está ampliamente indocumentada.
A finales del siglo XIX, el desarrollo de muestras muy delgadas y consistentemente delgadas mediante microtomía, junto con la tinción selectiva de importantes componentes celulares o moléculas, permitió la visualización de detalles microscópicos. [10] [11]
Hoy en día, la mayoría de los micrótomos tienen un diseño de bloque de cuchillas con una cuchilla intercambiable, un portamuestras y un mecanismo de avance. En la mayoría de los dispositivos, el corte de la muestra comienza moviendo la muestra sobre la cuchilla, donde el mecanismo de avance avanza automáticamente de manera que se puede realizar el siguiente corte para un espesor elegido. El espesor de la sección se controla mediante un mecanismo de ajuste, lo que permite un control preciso.
Las aplicaciones más comunes de los micrótomos son:
Un desarrollo reciente es el microtomo láser , que corta la muestra objetivo con un láser de femtosegundo en lugar de un cuchillo mecánico. Este método no requiere contacto y no requiere técnicas de preparación de muestras. El microtomo láser tiene la capacidad de cortar casi todos los tejidos en su estado original. Dependiendo del material a procesar, son posibles espesores de corte de 10 a 100 µm.
Los intervalos de sección se pueden clasificar principalmente en:
Un micrótomo de trineo es un dispositivo en el que la muestra se coloca en un soporte fijo (lanzadera), que luego se mueve hacia adelante y hacia atrás a través de un cuchillo. Los micrótomos de trineo modernos tienen el trineo colocado sobre un cojinete lineal, un diseño que permite al microtomo cortar fácilmente muchas secciones gruesas. [13] Al ajustar los ángulos entre la muestra y la cuchilla del microtomo, se puede reducir la presión aplicada a la muestra durante el corte. [13] Las aplicaciones típicas de este diseño de microtomo son la preparación de muestras grandes, como las incluidas en parafina para preparaciones biológicas. El espesor de corte típico que se puede lograr en un micrótomo de trineo es de entre 1 y 60 μm.
Este instrumento es un diseño de microtomo común. Este dispositivo funciona con una acción giratoria por etapas de modo que el corte real sea parte del movimiento giratorio. En un microtomo rotatorio, la cuchilla normalmente se fija en posición vertical. [14]
En la figura de la izquierda se explica el principio del corte. Mediante el movimiento del portamuestras, la muestra se corta con la cuchilla de la posición 1 a la posición 2, momento en el que la sección fresca permanece en la cuchilla. En el punto más alto del movimiento giratorio, el portamuestras avanza con el mismo espesor que la sección que se va a realizar, permitiendo realizar la siguiente sección.
El volante de muchos micrótomos se puede accionar manualmente. Esto tiene la ventaja de que se puede realizar un corte limpio, ya que la masa relativamente grande del volante impide que la muestra se detenga durante el corte de la muestra. El volante en los modelos más nuevos suele estar integrado dentro de la carcasa del microtomo. El espesor de corte típico de un micrótomo rotatorio está entre 1 y 60 µm. Para materiales duros, como una muestra incrustada en una resina sintética, este diseño de microtomo puede permitir buenas secciones "semifinas" con un espesor de tan solo 0,5 μm.
Para cortar muestras congeladas, muchos micrótomos rotatorios se pueden adaptar para cortar en una cámara de nitrógeno líquido, en una configuración denominada criomicrotomo. La temperatura reducida permite aumentar la dureza de la muestra, por ejemplo sometiéndola a una transición vítrea, que permite la preparación de muestras semifinas. [13] Sin embargo, la temperatura de la muestra y la temperatura de la cuchilla deben controlarse para optimizar el espesor de la muestra resultante.
Un ultramicrotomo es una herramienta principal de la ultramicrotomía . Permite la preparación de secciones extremadamente delgadas, funcionando el dispositivo de la misma manera que un micrótomo rotacional, pero con tolerancias muy estrictas en la construcción mecánica. Como resultado de la cuidadosa construcción mecánica, la expansión térmica lineal del soporte se utiliza para proporcionar un control muy fino del espesor. [13]
Estos cortes extremadamente finos son importantes para su uso con el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBFSEM) y, a veces, también son importantes para la microscopía óptica óptica. [14] El espesor típico de estos cortes es entre 40 y 100 nm para microscopía electrónica de transmisión y, a menudo, entre 30 y 50 nm para SBFSEM. También se toman secciones más gruesas de hasta 500 nm para aplicaciones TEM especializadas o para secciones de estudio de microscopía óptica para seleccionar un área para las secciones delgadas finales. Con los ultramicrótomos se utilizan cuchillas de diamante (preferiblemente) y cuchillas de vidrio. Para recolectar las secciones, se hacen flotar sobre un líquido a medida que se cortan y se recogen con cuidado sobre rejillas adecuadas para la visualización de muestras TEM. El espesor de la sección se puede estimar mediante los colores de interferencia de la luz reflejada en películas delgadas que se ven como resultado del espesor extremadamente pequeño de la muestra. [15]
El microtomo vibratorio funciona cortando usando una cuchilla vibratoria, lo que permite realizar el corte resultante con menos presión de la que se requeriría para una cuchilla estacionaria. El microtomo vibratorio se utiliza habitualmente para muestras biológicas difíciles. [13] El espesor del corte suele ser de alrededor de 30 a 500 μm para tejido vivo y de 10 a 500 μm para tejido fijo. [dieciséis]
El micrótomo de sierra es especial para materiales duros como dientes o huesos. El micrótomo de este tipo dispone de una sierra giratoria empotrada que corta la muestra. El espesor de corte mínimo es de aproximadamente 30 μm y puede realizarse para muestras comparativamente grandes. [13]
El microtomo láser es un instrumento para cortar sin contacto. [17] No se requiere preparación previa de la muestra mediante inclusión, congelación o fijación química, lo que minimiza los artefactos de los métodos de preparación. Alternativamente, este diseño de microtomo también se puede utilizar para materiales muy duros, como huesos o dientes, así como algunas cerámicas. Dependiendo de las propiedades del material de muestra, el espesor alcanzable se sitúa entre 10 y 100 µm.
El dispositivo funciona mediante la acción de corte de un láser infrarrojo. Como el láser emite radiación en el infrarrojo cercano, en este régimen de longitud de onda el láser puede interactuar con materiales biológicos. Mediante un enfoque nítido de la sonda dentro de la muestra, se puede lograr un punto focal de muy alta intensidad, hasta TW /cm 2 . Mediante la interacción no lineal de la penetración óptica en la región focal se produce una separación de materiales en un proceso conocido como fotodisrupción. Al limitar la duración del pulso láser al rango de femtosegundos, la energía gastada en la región objetivo se controla con precisión, limitando así la zona de interacción del corte a menos de un micrómetro. Fuera de esta zona, el tiempo de aplicación del haz ultracorto introduce un daño térmico mínimo o nulo al resto de la muestra.
La radiación láser se dirige a un sistema óptico basado en espejos de escaneo rápido, que permite el posicionamiento tridimensional del cruce del haz, al tiempo que permite el recorrido del haz hasta la región de interés deseada. La combinación de alta potencia con una alta velocidad de trama permite que el escáner corte grandes áreas de muestra en poco tiempo. En el microtomo láser también es posible la microdisección láser de áreas internas de tejidos, estructuras celulares y otros tipos de pequeñas características.
La selección del perfil de la hoja de la cuchilla del micrótomo depende del material y la preparación de las muestras, así como de los requisitos finales de la muestra (por ejemplo, espesor y calidad del corte).
Generalmente, los cuchillos se caracterizan por el perfil de la hoja, que se clasifica en las categorías de diseños planos cóncavos, en forma de cuña o en forma de cincel.
Las cuchillas planas cóncavas del microtomo son extremadamente afiladas, pero también muy delicadas y, por tanto, sólo se utilizan con muestras muy blandas. [14] Las cuchillas de perfil de cuña son algo más estables y se utilizan en materiales moderadamente duros, como en el corte de muestras criogénicas o epoxi. Finalmente, el perfil de cincel con su borde romo aumenta la estabilidad del cuchillo, al tiempo que requiere mucha más fuerza para realizar el corte.
Para los ultramicrótomos se necesitan cuchillas de vidrio y de diamante, por lo que la anchura de corte de la hoja es del orden de unos pocos milímetros y, por lo tanto, es significativamente más pequeña que en las cuchillas de micrótomo clásicas. Los cuchillos de vidrio generalmente se fabrican mediante la fractura de barras de vidrio utilizando dispositivos de fractura especiales "fabricantes de cuchillos". Se pueden utilizar cuchillas de vidrio para la preparación inicial de muestras incluso cuando se pueden utilizar cuchillas de diamante para el corte final. Los cuchillos de vidrio suelen tener pequeños canales, hechos con cinta plástica, que se llenan de agua para permitir que la muestra flote para su posterior recolección. [13] Se pueden incorporar discos de diamante en un canal existente, lo que permite el mismo método de recolección.
Antes del corte con micrótomo, los materiales biológicos suelen colocarse en un fijador más rígido, en un proceso conocido como incrustación. Esto se logra mediante la entrada de una sustancia líquida alrededor de la muestra, como parafina (cera) o epoxi, que se coloca en un molde y luego se endurece para producir un "bloque" que se corta fácilmente.
La declinación es el ángulo de contacto entre la muestra vertical y la hoja del cuchillo. Si la hoja del cuchillo está en ángulo recto (declinación = 90), el corte se realiza directamente usando un modo basado en presión y, por lo tanto, las fuerzas son proporcionalmente mayores. Sin embargo, si la cuchilla está inclinada, el movimiento relativo de la misma es cada vez más paralelo al movimiento de la muestra, lo que permite una acción de corte. Este comportamiento es muy importante para muestras grandes o duras.
La inclinación de la cuchilla es el ángulo entre la cara de la cuchilla y la muestra. Para un resultado óptimo, este ángulo debe elegirse adecuadamente. El ángulo óptimo depende de la geometría de la cuchilla, la velocidad de corte y muchos otros parámetros. Si el ángulo se ajusta a cero, el corte de la cuchilla a menudo puede volverse errático y se debe utilizar una nueva ubicación de la cuchilla para suavizarlo.
Si el ángulo es demasiado grande, la muestra puede arrugarse y la cuchilla puede provocar variaciones periódicas de espesor en el corte. Si se aumenta aún más el ángulo hasta que sea demasiado grande, se puede dañar la propia hoja del cuchillo.
