La microscopía de resonancia plasmónica de superficie ( SPRM ), también llamada imágenes por resonancia plasmónica de superficie ( SPRI ), [1] es una herramienta analítica sin etiquetas que combina la resonancia plasmónica de superficie de superficies metálicas con imágenes de la superficie metálica. [2] La heterogeneidad del índice de refracción de la superficie metálica imparte imágenes de alto contraste, causadas por el cambio en el ángulo de resonancia. [1] La SPRM puede lograr una sensibilidad de espesor subnanómetro [3] y la resolución lateral logra valores de escala micrométrica. [4] La SPRM se utiliza para caracterizar superficies como monocapas autoensambladas , películas multicapa , nanopartículas metálicas , matrices de oligonucleótidos y reacciones de unión y reducción. [5] [6] [7] [8] [ 9] Los polaritones plasmónicos de superficie son ondas electromagnéticas de superficie acopladas a electrones libres oscilantes de una superficie metálica que se propagan a lo largo de una interfaz metal/dieléctrico. [10] Dado que los polaritones son muy sensibles a pequeños cambios en el índice de refracción del material metálico, [11] se pueden utilizar como una herramienta de biodetección que no requiere etiquetado. Las mediciones de SPRM se pueden realizar en tiempo real, [12] como la medición de la cinética de unión de las proteínas de membrana en células individuales, [13] o la hibridación de ADN. [14] [15]
El concepto de SPR clásico existe desde 1968, pero la técnica de obtención de imágenes SPR fue introducida en 1988 por Rothenhäusler y Knoll. [16] Capturar una imagen de alta resolución de muestras de bajo contraste para técnicas de medición óptica es una tarea casi imposible hasta la introducción de la técnica SPRM que entró en existencia en el año 1988. En la técnica SPRM, las ondas de polaritón de superficie plasmónica (PSP) se utilizan para la iluminación. En palabras simples, la tecnología SPRI es una versión avanzada del análisis SPR clásico, donde la muestra se monitorea sin etiqueta mediante el uso de una cámara CCD. La tecnología SPRI con la ayuda de la cámara CCD brinda la ventaja de registrar los sensogramas y las imágenes SPR, y analiza simultáneamente cientos de interacciones. [17]
Los plasmones de superficie o polaritones de plasmones de superficie se generan mediante el acoplamiento del campo eléctrico con los electrones libres en un metal. [18] [19] Las ondas SPR se propagan a lo largo de la interfaz entre los dieléctricos y una capa conductora rica en electrones libres. [20]
Como se muestra en la Figura 2, cuando la luz pasa de un medio con un índice de refracción alto a un segundo medio con un índice de refracción más bajo, la luz se refleja totalmente bajo ciertas condiciones. [21]
Para obtener la reflexión interna total (TIR), θ 1 y θ 2 deben estar dentro de un cierto rango que se puede explicar mediante la ley de Snell. Cuando la luz pasa a través de un medio con un índice de refracción alto hacia un medio con un índice de refracción más bajo, se refleja en un ángulo θ 2 , que se define en la ecuación 1. [ cita requerida ]
En el proceso TIR, una parte de la luz reflejada deja escapar una pequeña parte de la intensidad del campo eléctrico hacia el medio 2 ( η 1 > η 2 ). La luz que se filtra hacia el medio 2 penetra como una onda evanescente. La intensidad y la profundidad de penetración de la onda evanescente se pueden calcular de acuerdo con las ecuaciones 2 y 3, respectivamente. [22]
La figura 3 muestra una representación esquemática de plasmones superficiales acoplados a oscilaciones de densidad electrónica. La onda de luz queda atrapada en la superficie de la capa metálica por acoplamiento colectivo con los electrones de la superficie metálica. Cuando el plasma del electrón y el campo eléctrico de la onda de luz acoplan sus oscilaciones de frecuencia, entran en resonancia. [23] [24]
Recientemente, se han obtenido imágenes de la luz de fuga dentro de la superficie del metal. [25] La radiación de diferentes longitudes de onda (verde, roja y azul) se convirtió en polaritones plasmónicos de superficie, a través de la interacción de los fotones en la interfaz metal/dieléctrico. Se utilizaron dos superficies metálicas diferentes: oro y plata. Se comparó la longitud de propagación del SPP a lo largo del plano xy (plano del metal) en cada metal y longitud de onda del fotón. La longitud de propagación se define como la distancia recorrida por el SPP a lo largo del metal antes de que su intensidad disminuya en un factor de 1/e, como se define en la ecuación 4. [ cita requerida ]
La Figura 4 muestra la luz de fuga capturada por una cámara CCD a color de los fotones verde, rojo y azul en películas de oro (a) y plata (b). En la parte c) de la Figura 4, se muestra la intensidad de los polaritones del plasmón superficial con la distancia. Se determinó que la intensidad de la luz de fuga es proporcional a la intensidad en la guía de ondas. [ cita requerida ]
donde δ SPP es la longitud de propagación; ε'm y ε''m son la permitividad relativa del metal y λ0 es la longitud de onda del espacio libre. [26]
La película metálica es capaz de absorber luz debido a la oscilación coherente de los electrones de la banda de conducción inducida por la interacción con un campo electromagnético. [27] Los electrones en la banda de conducción inducen polarización después de la interacción con el campo eléctrico de la radiación. Se crea una diferencia de carga neta en la superficie de la película metálica, creando una oscilación dipolar colectiva de electrones con la misma fase. [28] Cuando el movimiento de los electrones coincide con la frecuencia del campo electromagnético, se produce la absorción de la radiación incidente. La frecuencia de oscilación de los plasmones superficiales de oro se encuentra en la región visible del espectro electromagnético, dando un color rojo mientras que la plata da un color amarillo. [29] Las nanobarras exhiben dos picos de absorción en la región UV-vis debido a la oscilación longitudinal y transversal, para las nanobarras de oro la oscilación transversal genera un pico a 520 nm, mientras que la oscilación longitudinal genera absorción a longitudes de onda más largas, dentro de un rango de 600 a 800 nm. [29] [30] Las nanopartículas de plata cambian sus longitudes de onda de absorción de luz a niveles de energía más altos, donde el cambio al azul va de 408 nm a 380 nm y 372 nm, cuando cambian de esfera a varilla y alambre, respectivamente. [31] La intensidad de absorción y la longitud de onda del oro y la plata dependen del tamaño y la forma de las partículas. [32]
En la Figura 5, el tamaño y la forma de las nanopartículas de plata influyeron en la intensidad de la luz dispersada y la longitud de onda máxima de las nanopartículas de plata. Las partículas con forma triangular aparecen en rojo con una luz dispersa máxima a 670–680 nm, las partículas pentagonales aparecen en verde (620–630 nm) y las partículas esféricas tienen energías de absorción más altas (440–450 nm), aparecen en azul. [33]
Los polaritones plasmónicos superficiales son cuasipartículas compuestas por ondas electromagnéticas acopladas a electrones libres de la banda de conducción de los metales. [34] Uno de los métodos más utilizados para acoplar la luz p-polarizada con la interfaz metal-dieléctrica es el acoplamiento basado en prismas. [35] Los acopladores de prismas son los más utilizados para excitar polaritones plasmónicos superficiales. Este método también se denomina configuración Kretschmann-Raether, donde TIR crea una onda evanescente que acopla los electrones libres de la superficie del metal. [36] Se han explorado lentes objetivo de alta apertura numérica como una variante del acoplamiento de prismas para excitar polaritones plasmónicos superficiales. [15] El acoplamiento de guía de ondas también se utiliza para crear plasmones superficiales.
La configuración Kretschmann-Raether se utiliza para lograr resonancia entre la luz y los electrones libres de la superficie del metal. En esta configuración, un prisma con un alto índice de refracción se interconecta con una película metálica. La luz de una fuente se propaga a través del prisma y se hace incidir sobre la película metálica. Como consecuencia de la TIR, parte de la luz se filtra a través de la película metálica, formando una onda evanescente en el medio dieléctrico, como se muestra en la Figura 6. [12] La onda evanescente penetra una distancia característica en el medio ópticamente menos denso, donde se atenúa. [37]
La figura 6 muestra la configuración de Kretschmann-Raether, donde un prisma con índice de refracción de η 1 está acoplado a una superficie dieléctrica con un índice de refracción η 2 , el ángulo de incidencia de la luz es θ .
La interacción entre la luz y los polaritones de la superficie en el TIR se puede explicar utilizando la reflexión multicapa de Fresnel; el coeficiente de reflexión de amplitud ( r pmd ) se expresa de la siguiente manera en la ecuación 5. [38]
El coeficiente de reflexión de potencia R se define de la siguiente manera:
En la Figura 7 se muestra una representación esquemática del prisma de acoplamiento del prisma Otto. En la Figura 7, el espacio de aire se muestra un poco grueso solo para explicar el esquema, aunque en realidad, el espacio de aire es muy delgado entre el prisma y la capa de metal.
Las ondas electromagnéticas se conducen a través de una guía de ondas óptica. Cuando la luz entra en la región con una capa metálica delgada, penetra evanescentemente a través de la capa metálica excitando una onda plasmónica superficial (SPW). En la configuración de acoplamiento de la guía de ondas, la guía de ondas se crea cuando el índice de refracción de la rejilla es mayor que el del sustrato. La radiación incidente se propaga a lo largo de la capa de guía de ondas con un índice de refracción alto. [39] En la Figura 8, las ondas electromagnéticas se guían a través de una capa guía de ondas, una vez que las ondas ópticas alcanzan la interfaz de la capa guía de ondas metálica, se crea una onda evanescente. La onda evanescente excita el plasmón superficial en la interfaz metal-dieléctrico. [40]
Debido a la rejilla periódica, la coincidencia de fase entre la luz incidente y el modo guía es fácil de obtener. [41] Según la ecuación 7, el vector de propagación ( Kz ) en la dirección z se puede ajustar cambiando la periodicidad Λ. El vector de rejilla se puede modificar y el ángulo de excitación resonante se puede controlar. [42] En la Figura 9, q es el orden de difracción; puede tener valores de cualquier número entero (positivo, negativo o cero). [43]
La constante de propagación de un haz de luz monocromático paralelo a la superficie está definida por la ecuación 8. [44]
donde θ es el ángulo de incidencia, k sp es la constante de propagación del plasmón superficial y n ( p ) es el índice de refracción del prisma. Cuando el vector de onda del SPW, k sp coincide con el vector de onda de la luz incidente , SPW se expresa como: [44]
Aquí εd y εm representan la constante dieléctrica de los dieléctricos y el metal, mientras que la longitud de onda de la luz incidente corresponde a λ . kx y ksp se pueden representar como: [44]
Los plasmones de superficie son ondas evanescentes que tienen su máxima intensidad en la interfaz y decaen exponencialmente a medida que se alejan del límite de fase hasta una profundidad de penetración. [13] La propagación de los plasmones de superficie se ve intensamente afectada por una fina capa de película sobre la capa conductora. El ángulo de resonancia θ cambia, cuando la superficie metálica está recubierta con un material dieléctrico, debido al cambio del vector de propagación k del plasmón de superficie. [45] Esta sensibilidad se debe a la poca profundidad de penetración de la onda evanescente. Se utilizan materiales con una gran cantidad de electrones libres. Se utilizan películas metálicas de aproximadamente 50 nm hechas de cobre, titanio, cromo y oro. Sin embargo, Au es el metal más común utilizado en SPR así como en SPRM.
El método de detección de interacciones biomoleculares (SPR) por ángulo de barrido es el más utilizado. [40] Mide el porcentaje de reflectancia (%R) de un conjunto prisma/película metálica en función del ángulo de incidencia a una longitud de onda de excitación fija. Cuando el ángulo de incidencia coincide con la constante de propagación de la interfaz, este modo se excita con el gasto de la luz reflejada. Como consecuencia, se descarta el valor de reflectividad en el ángulo de resonancia. [46]
La constante de propagación de los polaritones se puede modificar variando el material dieléctrico. Esta modificación provoca un desplazamiento del ángulo de resonancia como en el ejemplo que se muestra en la Figura 10, de θ 1 a θ 2 debido al cambio en la constante de propagación del plasmón superficial.
El ángulo de resonancia se puede encontrar utilizando la ecuación 11.
donde n 1 es n 2 y n g son el índice de refracción del medio 1, 2 y la capa metálica, respectivamente. [46]
Mediante la obtención de imágenes bidimensionales TIR es posible lograr diferencias espaciales en %R en un ángulo fijo θ . Se utiliza un haz de luz monocromática para irradiar la muestra en un ángulo de incidencia fijo. La imagen SPR se crea a partir de la luz reflejada detectada por una cámara CCD. [13] El valor mínimo de %R en el ángulo de resonancia proporciona SPRM. [8]
Huang y colaboradores desarrollaron un microscopio con un objetivo de alta apertura numérica (NA), que mejora la resolución lateral a expensas de la resolución longitudinal. [47]
La resolución de un microscopio óptico convencional está limitada por el límite de difracción de la luz. En SPRM, los plasmones superficiales excitados adoptan una configuración horizontal a partir del haz de luz incidente. Los polaritones viajarán a lo largo de la interfaz metal-dieléctrico, durante un período determinado, hasta que se desintegran nuevamente en fotones. Por lo tanto, la resolución lograda por SPRM está determinada por la longitud de propagación ksp de los plasmones superficiales paralelos al plano incidente. [46] La separación entre dos áreas debe ser aproximadamente la magnitud de ksp para que se pueda resolver. Berger, Kooyman y Greve demostraron que la resolución lateral se puede ajustar cambiando la longitud de onda de excitación, y se logra una mejor resolución cuando aumenta la energía de excitación. Las ecuaciones 4 y 12 definen la magnitud del vector de onda de los plasmones superficiales. [48]
donde n 2 es el índice de refracción del medio 2, n g es el índice de refracción de la película metálica y λ es la longitud de onda de excitación. [46]
La microscopía de resonancia plasmónica de superficie se basa en la resonancia plasmónica de superficie y en la grabación de imágenes deseadas de las estructuras presentes en el sustrato mediante un instrumento equipado con una cámara CCD. En la última década, se ha demostrado que la detección por resonancia plasmónica de superficie es una técnica sumamente potente y se utiliza ampliamente en la investigación y el desarrollo de materiales, bioquímica y ciencias farmacéuticas. [49]
El instrumento SPRM funciona con la combinación de los siguientes componentes principales: luz de fuente (normalmente láser He-Ne), que viaja a través de un prisma que está unido a un lado de vidrio, recubierto con una película fina de metal (normalmente oro o plata), donde el haz de luz se refleja en la interfaz oro/solución en un ángulo mayor que el ángulo crítico. [1] La luz reflejada desde el área de la superficie de la interfaz es registrada por un detector CCD, y se registra una imagen. Aunque los componentes mencionados anteriormente son algunos importantes para SPRM, accesorios adicionales como polarizadores, filtros, expansores de haz, lentes de enfoque, platina giratoria, etc., similares a varios métodos de obtención de imágenes, se instalan y utilizan en la instrumentación para una técnica microscópica efectiva según lo exija la aplicación. La Figura 12 muestra un SPRM típico. Dependiendo de las aplicaciones, y para optimizar la técnica de obtención de imágenes, los investigadores modifican esta instrumentación básica con algunos cambios de diseño que incluso incluyen alterar el haz de fuente. Uno de esos cambios de diseño que resultó en un SPRM diferente es un tipo objetivo como se muestra en la Figura 11 con algunas modificaciones en la configuración óptica. [47]
Los sistemas SPRi son fabricados actualmente por conocidos fabricantes de instrumentación biomédica como GE Life Sciences, HORIBA, Biosensing USA, etc. El coste del SPRi oscila entre 100.000 y 250.000 dólares, aunque se pueden realizar prototipos de demostración sencillos por 2.000 dólares. [50]
Para realizar mediciones de SPRM, la preparación de la muestra es un paso crítico. Hay dos factores que pueden verse afectados por el paso de inmovilización: uno es la confiabilidad y reproducibilidad de los datos adquiridos. Es importante garantizar la estabilidad del elemento de reconocimiento, como anticuerpos, proteínas, enzimas, en las condiciones del experimento. Además, la estabilidad de las muestras inmovilizadas afectará la sensibilidad y/o el límite de detección (LOD). [51] [52]
Uno de los métodos de inmovilización más populares es la monocapa autoensamblada (SAM) sobre la superficie de oro. Jenkins y colaboradores (2001) utilizaron parches de mercaptoetanol rodeados de SAM compuesto de octadecanotiol (ODT) para estudiar la adsorción de fosfatidilcolina de huevo sobre la SAM del ODT. [5] Se realizó un patrón de ODT-mercaptoetanol sobre una película de oro de 50 nm. La película de oro se obtuvo mediante evaporación térmica sobre un vidrio LaSFN 9. Las vesículas lipídicas se depositaron sobre la SAM del ODT mediante adsorción, lo que dio un espesor de multicapa final mayor a 80 Å. [ cita requerida ]
Se formó una monocapa autoensamblada de ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA-SAM) en portaobjetos BK7 recubiertos de oro. Se enmascaró una placa de PDMS en el chip MUA-SAM. El clenbuterol (CLEN) se adhirió a las moléculas de BSA a través de un enlace amida, entre el grupo carboxílico de BSA y el grupo amina de las moléculas de CLEN. Para inmovilizar BSA en la superficie de oro, las manchas creadas mediante la fabricación de PDMS se funcionalizaron con sulfo-NHS y EDC, posteriormente se vertió una solución de BSA al 1% en las manchas y se incubó durante 1 hora. La BSA no inmovilizada se enjuagó con PBS y se vertió una solución de CLEN en las manchas, la CLEN no inmovilizada se eliminó mediante un enjuague con PBS. [53]
Se preparó un alcanotiol-SAM para medir simultáneamente la concentración de peroxidasa de rábano picante (Px), inmunoglobulina E humana (IgE), coriogonadotropina humana (hCG) e inmunoglobulina G humana (IgG), mediante SPR. Los alcanotioles formados por cadenas de carbono compuestas por 11 y 16 carbonos se autoensamblaron en el chip sensor. Los anticuerpos se adhirieron al alcanotiol C16, que tenía un grupo carboxílico terminal. [54]
El electrodo microestructurado se fabricó mediante deposición de oro sobre portaobjetos de microscopio. Se utilizó estampado de PDMS para producir una matriz de superficie hidrófila/hidrófoba; el tratamiento ODT seguido de inmersión en soluciones de 2-mercaptoetanol produjo una superficie funcionalizada para la deposición de membranas lipídicas. El electrodo estructurado se caracterizó mediante SPRM. En la Figura 14 B, la imagen SPRM revela el tamaño de las bolsas, que era de 100 um x 100 um, y estaban separadas por 200 um. Como se ve en la imagen, el notable contraste de la imagen se debe a la alta sensibilidad de la técnica. [ cita requerida ]
SPRM es una técnica útil para medir la concentración de biomoléculas en la solución, la detección de moléculas de unión y el monitoreo en tiempo real de interacciones moleculares. Puede usarse como biosensor para interacciones superficiales de moléculas biológicas: unión antígeno-anticuerpo, mapeo y cinética de sorción. Por ejemplo, una de las posibles razones de la diabetes tipo 1 de los niños es la presencia de alto nivel de anticuerpos de leche de vaca IgG, IgA, IgM (principalmente debido a IgA) en su suero. [55] Los anticuerpos de leche de vaca se pueden detectar en la muestra de leche y suero usando SPRM. [56] SPRM también es ventajoso para detectar la unión específica del sitio de linfocitos B o T en la matriz de anticuerpos. Esta técnica es conveniente para estudiar las interacciones libres de etiqueta y en tiempo real de las células en la superficie. Por lo tanto, SPRM puede servir como herramienta de diagnóstico para la cinética de adhesión a la superficie celular. [57] Además de sus méritos, existen limitaciones de SPRM. No es aplicable para detectar moléculas de bajo peso molecular. Aunque no tiene etiquetas, se requieren condiciones experimentales absolutamente limpias. La sensibilidad de la SPRM se puede mejorar con el acoplamiento de MALDI-MS. [58] Hay varias aplicaciones de la SPRM, algunas de las cuales se describen aquí.
Las proteínas de membrana son responsables de la regulación de las respuestas celulares a las señales extracelulares. Ha sido un desafío investigar la participación de las proteínas de membrana en biomarcadores de enfermedades y objetivos terapéuticos y su cinética de unión con sus ligandos. Los enfoques tradicionales no podían reflejar estructuras y funciones claras de las proteínas de membrana. [13] Para comprender los detalles estructurales de las proteínas de membrana, existe la necesidad de una herramienta analítica alternativa, que pueda proporcionar resoluciones tridimensionales y secuenciales que puedan monitorear las proteínas de membrana. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es un método excelente para obtener imágenes de alta resolución espacial de proteínas de membrana, [59] pero podría no ser útil para investigar su cinética de unión. La microscopía basada en fluorescencia (FLM) se puede utilizar para estudiar las interacciones de las proteínas de membrana en células individuales, pero requiere el desarrollo de etiquetas adecuadas y necesita tácticas para diferentes proteínas objetivo. [60] Además, la proteína huésped puede verse afectada por el etiquetado. [61]
La cinética de unión de las MP en las células vivas individuales se puede estudiar mediante un método de obtención de imágenes sin etiquetas basado en la microscopía SPR sin extraer las proteínas de las membranas celulares, lo que ayuda a los científicos a trabajar con las conformaciones reales de las proteínas de membrana. Además, se puede mapear y calcular la distribución y las actividades de unión local de las proteínas de membrana en cada célula. La microscopía SPR (SPRM) permite obtener imágenes ópticas y de fluorescencia simultáneamente de la misma muestra, lo que demuestra que se obtienen las ventajas de los métodos de detección tanto con etiquetas como sin etiquetas en una única configuración. [47] [62]
La obtención de imágenes SPR se utiliza para estudiar las interacciones de adsorción múltiple en un formato de matriz en las mismas condiciones experimentales. Nelson y sus colaboradores introdujeron un procedimiento de varios pasos para crear matrices de ADN sobre superficies de oro para su uso con la obtención de imágenes SPR. [63] Las interacciones de afinidad se pueden estudiar para una variedad de moléculas objetivo, por ejemplo, proteínas y ácidos nucleicos. La falta de coincidencia de bases en la secuencia de ADN conduce a una serie de enfermedades letales como el síndrome de Lynch, que conlleva un alto riesgo de cáncer de colon. [64]
La obtención de imágenes SPR es útil para monitorear la adsorción de moléculas en la superficie del oro, lo cual es posible debido al cambio en la reflectividad de la superficie. El primer par de desajustes GG se estabiliza uniéndolo con el ligando, dímero de naftiridina, a través de enlaces de hidrógeno que forman las estructuras de horquilla en el ADN bicatenario sobre la superficie del oro. La unión del dímero con el ADN mejora la energía libre de hibridación, lo que provoca un cambio en el índice de refracción. [65]
Se fabricó una matriz de ADN para probar las propiedades estabilizadoras del desajuste G–G del dímero de naftiridina. Cada una de las cuatro secuencias inmovilizadas en la matriz difería en una base. La posición de esta base está indicada por una X en la secuencia 1, como se muestra en la Figura 16. La imagen de diferencia SPR solo se detecta para la secuencia que tiene la base citosina (C) en la posición X en la secuencia 1, la secuencia complementaria a la secuencia 2. Sin embargo, la imagen de diferencia SPR correspondiente a la adición de la secuencia 2 en presencia del dímero de naftiridina muestra que, además de su complemento, la secuencia 2 también se hibrida con la secuencia que forma un desajuste G–G. Estos resultados demuestran que la obtención de imágenes SPR es una herramienta prometedora para monitorear desajustes de bases individuales y descartar las moléculas hibridadas. [65]
La obtención de imágenes SPR se puede utilizar para estudiar la unión de anticuerpos a una matriz de proteínas. [66] Las funcionalidades de amina en la superficie de oro con una matriz de proteínas se utilizan para estudiar la unión de anticuerpos. La inmovilización de la proteína se realizó haciendo fluir soluciones de proteína a través de los microcanales de PDMS. Luego, se eliminó el PDMS de la superficie y se hicieron fluir soluciones de anticuerpo sobre la matriz. La matriz de proteínas de tres componentes que contiene las proteínas fibrinógeno humano, ovoalbúmina e IgG bovina se muestra en la Figura 17, imágenes SPR obtenidas por Kariuki y colaboradores. Este contraste en la matriz se debe a la diferencia del índice de refracción que es el resultado de la unión local de anticuerpos. Estas imágenes muestran que existe un alto grado de especificidad de unión de anticuerpos y un pequeño grado de adsorción no específica del anticuerpo al fondo de la matriz, que se puede mejorar para modificar el fondo de la matriz. Con base en estos resultados, la técnica de obtención de imágenes SPR se puede optar como herramienta de diagnóstico para estudiar las interacciones de anticuerpos con matrices de proteínas. [66] [67]
El descubrimiento y la validación de biomarcadores proteicos son cruciales para el diagnóstico de enfermedades. El acoplamiento de SPRM con el espectrómetro de masas MALDI (SUPRA-MS) permite la cuantificación multiplex de la unión y la caracterización molecular en función de diferentes masas. SUPRA-MS se utiliza para detectar, identificar y caracterizar el potencial biomarcador del cáncer de mama, la proteína LAG3, introducida en el plasma humano. Se tomaron portaobjetos de vidrio para preparar chips de oro mediante el recubrimiento con capas delgadas de cromo y oro mediante un proceso de pulverización catódica. La superficie de oro se funcionalizó utilizando una solución de 11-mercapto-1-undecanol (11-MUOH) y ácido 16-mercapto-1-hexadecanoico (16-MHA). Esta monocapa autoensamblada se activó con sulfo-NHS y EDC. Se depositó un patrón de dieciséis gotitas en la macromatriz. Se detectaron anticuerpos de inmunoglobulina G contra el gen de activación de linfocitos 3 (α-LAG3) y albúmina sérica de rata (α-RSA). Después de colocar el biochip en el SPRi y hacer correr la solución tampón en la celda de flujo, se inyectó α-LAG3. Se utilizó una estación de imágenes especial en las proteínas que están adheridas. Esta estación también se puede colocar en el MALDI. Antes de colocarlo en el MALDI, las proteínas capturadas se redujeron, digirieron y cargaron con matriz para evitar la contaminación. [58]
La densidad del antígeno es directamente proporcional al cambio en la reflectividad ΔR porque la profundidad de penetración de la onda evanescente Lzc es mayor que el espesor de la capa de antígeno inmovilizado. [68]
donde es el incremento del índice de la molécula y es el prisma de sensibilidad, reflectividad.
Se obtuvo un espectro de masas limpio para la proteína LAG3 debido a una buena digestión tríptica y a la homogeneidad de la matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico). Se encontró un pico de intensidad m/z relativamente alto de la proteína LAG3 a 1422,70 uma con una puntuación mascota promedio de 87,9 ± 2,4. La validación de los resultados de MS se confirmó además mediante el análisis MS-MS. Estos resultados son similares a la digestión en gel con el método analítico clásico. [58]
Una relación señal / ruido superior a 10, una fiabilidad del 100 % y una detección a nivel de femtomol en el chip demuestran la credibilidad de esta técnica de acoplamiento. Se puede encontrar la interacción proteína-proteína y la distribución de péptidos en el chip con una alta resolución espacial utilizando la técnica sometida. [58]
Los aptámeros son ligandos de ADN particulares que se dirigen a biomoléculas como las proteínas. La plataforma de imágenes SPR sería una buena opción para caracterizar las interacciones aptámero-proteína. Para estudiar la interacción aptámero-proteína, primero se injertan oligonucleótidos a través de la formación de monocapa autoensamblable de tiol (SAM) en sustrato de oro utilizando un sistema de dispensación piezoeléctrico. Los grupos tiol se introducen en los nucleótidos de ADN mediante N-hidroxisuccinimida (NHS). Los oligonucleótidos diana que tienen un grupo amina primaria en su extremo 59 se conjugan con HS-C (11)-NHS en solución tampón de fosfato a pH 8,0 durante una hora a temperatura ambiente. [ cita requerida ] El biosensor de injerto de aptámero se coloca en SPRM después del enjuague. Luego, se coinyecta trombina con exceso de citocromo C para la especificidad de la señal. La concentración de trombina libre se determina mediante la curva de calibración obtenida al trazar la pendiente inicial de la señal al comienzo de la inyección contra la concentración. La interacción de la trombina y el aptámero se puede monitorear en microarrays en tiempo real durante inyecciones de trombina a diferentes concentraciones. La constante de disociación en fase de solución KDsol (3,16 ± 1,16 nM) se calcula a partir de las concentraciones medidas de trombina libre. [ cita requerida ]
[THR---APT] = cTHR – [THR], la concentración de equilibrio de trombina unida a aptámeros en solución y [APT] = cAPT – [THR---APT], la concentración de aptámeros libres en solución.
La constante de disociación de la fase superficial KDsurf (3,84 ± 0,68) se obtiene ajustando la isoterma de adsorción de Langmuir a las señales de equilibrio. Ambas constantes de disociación son significativamente diferentes porque KDsurf depende de la densidad de injerto de la superficie, como se muestra en la Figura 19. Esta dependencia se extrapola linealmente a baja sigma a la afinidad de la fase de solución. [ cita requerida ]
La diferencia en la imagen SPRi puede brindarnos información sobre la presencia de unión y especificidad, pero no es adecuada para la cuantificación de proteína libre en caso de múltiples sitios de afinidad. El monitoreo en tiempo real de la interacción es posible mediante el uso de SPRM para estudiar la cinética y la afinidad de las interacciones. [69]
A pesar de utilizar la resonancia de plasmones de superficie (SPRi) en biología para caracterizar las interacciones entre dos moléculas biológicas, también es útil para monitorear las interacciones entre dos polímeros. En este enfoque, un polímero, llamado proteína huésped HP, se inmoviliza en la superficie de un biochip y el otro polímero designado como polímero huésped GP se inserta en el SPRi-Biochip para estudiar las interacciones. Por ejemplo, una proteína huésped de poli(β-ciclodextrina) funcionalizada con amina y una proteína huésped de PEG (ada)4. [ cita requerida ]
El biochip SPRi se utilizó para la inmovilización de HP de diferentes concentraciones. Se produjo una serie de sitios activos de HP en el chip. La unión de HP se realizó a través de sus grupos amino a las funcionalidades de N-hidroxi succinimida en la superficie de oro. Primero se llenó el sistema SPRi con una solución tampón de funcionamiento seguida de la colocación del biochip SPRi en la cámara de análisis. Se inyectaron dos soluciones de diferentes concentraciones de GP de 1 g/L y 0,1 g/L en la celda de flujo. La asociación y la disociación de ambos polímeros se pueden monitorear en tiempo real en función del cambio en la reflectividad y las imágenes de SPRM se pueden diferenciar en función de los puntos blancos (fase de asociación) y los puntos negros (fase de disociación). El PEG sin grupos adamantilo no mostró adsorción en las cavidades de β-ciclodextrina. Por otro lado, no hubo adsorción de GP sin HP en el chip. El cambio en la respuesta de SPRi en los sitios de reacción se proporciona mediante la captura de curvas cinéticas e imágenes en tiempo real de la cámara CCD. Los cambios locales en la reflectividad de la luz están directamente relacionados con la cantidad de moléculas objetivo en cada punto. La variación en la superficie del chip proporciona un conocimiento completo sobre la unión molecular y los procesos cinéticos. [70]
Una de las clases importantes de biomateriales es la hidroxiapatita polimérica, que es notablemente útil en el campo de la regeneración ósea debido a su semejanza con el material óseo natural. La ventaja de la hidroxiapatita, (Ca10(PO4)6(OH)2, es que se empieza a formar dentro del tejido óseo a través de la mineralización, lo que también favorece la mejora de la osteointegración. La biomineralización también se denomina calcificación, en la que los cationes de calcio provienen de las células y los fluidos fisiológicos, mientras que los aniones de fosfato se producen a partir de la hidrólisis de fosfoésteres y fosfoproteínas, así como de los fluidos corporales. Este fenómeno también se ha probado en estudios in vitro. [ cita requerida ]
Para los estudios in vitro, los dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) con capas reactivas externas de amino y ácido carboxílico se consideran como fase de detección. Estos dendrímeros deben estar inmovilizados en la superficie del oro y ser inactivos en la superficie del oro. Por lo tanto, los grupos tioles deben introducirse en las terminales de los dendrímeros para que los dendrímeros puedan unirse a la superficie del oro. Los grupos carboxílicos se funcionalizan mediante soluciones de clorhidrato de N,N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) en tampón de fosfato. Los grupos funcionales (amida, amino y carboxilo) actúan como bombas iónicas que capturan iones de calcio de los fluidos de prueba; luego, los cationes de calcio se unen con aniones de fosfato para generar núcleos minerales de fosfato de calcio en la superficie del dendrímero. [ cita requerida ]
Se espera que el SPRM sea lo suficientemente sensible como para proporcionar información cuantitativa importante sobre la ocurrencia y la cinética de la mineralización. Esta detección de la mineralización se basa en el cambio de masa específico inducido por la formación y el crecimiento de los núcleos minerales. La nucleación y el progreso de la mineralización se pueden monitorear mediante el SPRM como se muestra en la Figura 20. Los sensores que contienen PAMAM se fijan en la plataforma de análisis SPRi y luego se exponen a fluidos experimentales en la celda de flujo como se muestra en la Figura 21. El SPRM no está adaptado para detectar el origen y la naturaleza del cambio de masa, pero detecta la modificación del índice de refracción debido a la precipitación mineral. [ cita requerida ]
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