Ataque al promotor de un promotor hipotético de dos regiones. El promotor se clona aguas arriba del gen reportero lacZ . Se realizan mutaciones puntuales que inactivan cada región (las X rojas) y la región se clona en un plásmido y se inserta en células de E. coli , se cultiva y se mide la presencia del reportero. La unión de la proteína B en este ejemplo es necesaria para que la ARN polimerasa se una e inicie la transcripción . En un entorno de laboratorio, es posible que no se sepa que el promotor consta de dos regiones: se pueden realizar mutaciones individuales a lo largo del promotor, se puede secuenciar el promotor y se pueden analizar los niveles del reportero para encontrar los límites de cada región.
El ataque al promotor es una técnica utilizada en biología molecular para identificar cómo ciertas regiones de una cadena de ADN , comúnmente promotores , afectan la transcripción de genes posteriores. En circunstancias normales, las proteínas se unen al promotor y activan o reprimen la transcripción. En un ensayo de ataque al promotor, se realizan mutaciones puntuales o deleciones específicas en regiones específicas del promotor y luego se mide la transcripción del gen. La contribución de una región del promotor se puede observar por el nivel de transcripción. Si una mutación o deleción cambia el nivel de transcripción, entonces se sabe que esa región del promotor puede ser un sitio de unión u otro elemento regulador. [1] [2] [3]
La eliminación de promotores se realiza a menudo con deleciones del extremo 5' o 3' de la cadena de ADN; este ensayo es más fácil de realizar basándose en la digestión de restricción repetida y la purificación en gel de fragmentos de tamaños específicos. A menudo es más fácil ligar el promotor al reportero, generar una gran cantidad de la construcción del reportero mediante PCR o crecimiento en bacterias y luego realizar digestores de restricción en serie en esta muestra. La capacidad de los promotores ascendentes se puede ensayar fácilmente eliminando segmentos del extremo 5', y lo mismo para el extremo 3' de la cadena para los promotores descendentes. [4]
Como el promotor contiene comúnmente secuencias de unión para proteínas que afectan la transcripción, esas proteínas también son necesarias cuando se prueban los efectos del promotor. Las proteínas que se asocian con el promotor se pueden identificar utilizando un ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA), y los efectos de la inclusión o exclusión de las proteínas con los promotores mutagenizados se pueden evaluar en el ensayo. Esto permite el uso del ataque al promotor no solo para descubrir la ubicación en la cadena de ADN que afecta la transcripción, sino también las proteínas que afectan a esa cadena. Los efectos de las interacciones de las proteínas entre sí, así como los sitios de unión, también se pueden analizar de esta manera; las proteínas candidatas deben identificarse en cambio mediante ensayos de interacción proteína-proteína en lugar de un EMSA. [5]
Procedimiento
Este es un ejemplo de procedimiento para un ensayo de ataque al promotor, adaptado de Boulin et al.: [ 6]
Clonar la región de ADN que se cree que actúa como promotor. La clonación es necesaria para el ensayo porque garantiza que el promotor sea el único factor que afecte la expresión. Este paso a menudo implica la extracción del ADN del organismo en el que reside y la amplificación por PCR .
Secuenciar la región. La secuenciación del ADN es necesaria para identificar las diferencias entre los promotores mutados y el promotor de tipo salvaje, y para correlacionar esas diferencias con las diferencias en la expresión génica. Además, ayuda con la digestión de restricción de la región.
Digerir con endonucleasas de restricción adecuadas. La región se puede digerir para eliminar elementos que se cree que no forman parte del promotor. Además, el gen reportero debe insertarse a una distancia determinada del promotor para la mayoría de los promotores. En algunos métodos de ataque al promotor, se utilizan múltiples digestos de restricción para eliminar sistemáticamente elementos de los promotores; este método garantiza que las regiones del promotor eliminadas no contribuyan a la expresión del reportero .
Mutageneizar el promotor. La mutación del promotor es necesaria si no se utiliza el método de eliminación de parte del promotor con digestión de restricción. Se pueden generar muchas cadenas mutadas, secuenciarlas y analizar las actividades de los promotores. Esto suele ser necesario porque no se puede garantizar que una mutación inactive un sitio de unión. También se puede utilizar mutagénesis no dirigida basada en PCR; los parámetros de la reacción de PCR mutagénica se pueden ajustar para introducir una cantidad razonable de mutaciones. Sin embargo, la naturaleza aleatoria de la PCR requiere que se analicen más cadenas después de este paso.
Ligar al gen reportero. Los promotores que se van a analizar deben estar ligados a un gen reportero para poder medir los niveles de expresión génica. El gen reportero debe estar a una distancia suficiente del promotor para que este lo afecte como lo haría un promotor de tipo salvaje. Esto se puede verificar con el control positivo (promotor completo).
Transformar las células de interés con las distintas construcciones promotor-reportero. Las construcciones promotora y reportera deben ligarse a un plásmido y transformarse en células en las que se pueda expresar ese plásmido para medir la actividad de cada secuencia promotora. Las proteínas que afectan al promotor también deben agregarse a esas células; a menudo, esas proteínas se colocan en el mismo plásmido o en uno diferente bajo la regulación de un promotor constitutivamente activo.
Medir las tasas de transcripción de genes reporteros. Se analizan los productos génicos y se miden las tasas de transcripción de genes reporteros.
A partir de los datos obtenidos al analizar los diferentes promotores, se pueden determinar los efectos de las distintas partes del promotor. Sin embargo, es posible que no haya suficientes datos disponibles y que el ensayo deba repetirse con una región promotora diferente y/o con mutaciones diferentes.
^ Kamvysselis, M. (2003). Genómica molecular computacional: genes, regulación, evolución . (Tesis doctoral). Recuperado de http://web.mit.edu/manoli/www/thesis/Intro.html
^ Chalfie, M. y Kain, S. (2005) Métodos de análisis biológicos, Proteína fluorescente verde: propiedades, aplicaciones y protocolos . Wiley.
^ Matsukura, S., Stellato, C., Plitt, JR, Bickel, C., Miura, K., Georas, SN, Casolaro, V., Schleimer, RP (1999). "Activación de la transcripción del gen de la eotaxina por NF-κB y STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias humanas". J Immunol 163:6876-6883. PMID 10586089.
^ Engstrom, EM, Izhaki, A., Bowman, JL (2004). "Ataque a promotores, microARN y genes Knox. Nuevos conocimientos, reguladores y objetivos de regulación en el establecimiento de la polaridad de los órganos laterales en Arabidopsis". Plant Phisiol 135(2): 685-94. doi : 10.1104/pp.104.040394. PMID 15208415. PMC 514105.
^ Guo, JY, Xu, J., Mao, DQ, Fu, LL, Gu, JR, Zhu, JD (2002). "Análisis del promotor del gen humano C17orf25 , un nuevo gen del cromosoma 17p13.3". Cell Research 12:339-352. doi :10.1038/sj.cr.7290136.
^ Boulin, T. et al. Reporter gene fusions (5 de abril de 2006), WormBook , ed. The C. elegans Research Community, WormBook, doi 10.1895/wormbook.1.106.1, http://www.wormbook.org.
