La huella de ADN es un método para investigar la especificidad de la secuencia de las proteínas que se unen al ADN in vitro. Esta técnica se puede utilizar para estudiar las interacciones proteína-ADN tanto fuera como dentro de las células.
La regulación de la transcripción ha sido ampliamente estudiada, pero aún queda mucho por saber. Los factores de transcripción y las proteínas asociadas que se unen a los promotores , potenciadores o silenciadores para impulsar o reprimir la transcripción son fundamentales para comprender la regulación única de genes individuales dentro del genoma . Las técnicas como la huella de ADN ayudan a dilucidar qué proteínas se unen a estas regiones asociadas de ADN y a desentrañar las complejidades del control transcripcional.
En 1978, David J. Galas y Albert Schmitz desarrollaron la técnica de la huella de ADN para estudiar la especificidad de unión de la proteína represora lac. Originalmente era una modificación de la técnica de secuenciación química Maxam-Gilbert. [1]
La aplicación más simple de esta técnica es evaluar si una proteína dada se une a una región de interés dentro de una molécula de ADN. [2] La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica y marca la región de interés que contiene un sitio de unión de proteína potencial, idealmente el amplicón tiene entre 50 y 200 pares de bases de longitud. Agregue la proteína de interés a una porción del ADN de plantilla marcado; una porción debe permanecer separada sin proteína, para una comparación posterior. Agregue un agente de escisión a ambas porciones de la plantilla de ADN. El agente de escisión es una sustancia química o enzima que cortará en ubicaciones aleatorias de una manera independiente de la secuencia. La reacción debe ocurrir el tiempo suficiente para cortar cada molécula de ADN en una sola ubicación. Una proteína que se une específicamente a una región dentro de la plantilla de ADN protegerá al ADN al que está unida del agente de escisión. Ejecute ambas muestras una al lado de la otra en una electroforesis en gel de poliacrilamida . La porción de la plantilla de ADN sin proteína se cortará en ubicaciones aleatorias y, por lo tanto, cuando se ejecute en un gel, producirá una distribución similar a una escalera. La plantilla de ADN con la proteína dará como resultado una distribución en escalera con una ruptura, la "huella", donde el ADN ha sido protegido del agente de escisión. Nota: La secuenciación química de ADN de Maxam-Gilbert se puede ejecutar junto con las muestras en el gel de poliacrilamida para permitir la predicción de la ubicación exacta del sitio de unión del ligando.
La plantilla de ADN marcada en el extremo 3' o 5', dependiendo de la ubicación del sitio de unión. Las etiquetas que se pueden utilizar son: radioactividad y fluorescencia . La radioactividad se ha utilizado tradicionalmente para etiquetar fragmentos de ADN para el análisis de huellas, ya que el método se desarrolló originalmente a partir de la técnica de secuenciación química Maxam-Gilbert. El etiquetado radiactivo es muy sensible y es óptimo para visualizar pequeñas cantidades de ADN. La fluorescencia es un avance deseable debido a los peligros del uso de radioquímicos. Sin embargo, ha sido más difícil de optimizar porque no siempre es lo suficientemente sensible para detectar las bajas concentraciones de las cadenas de ADN objetivo utilizadas en los experimentos de huellas de ADN. Los geles de secuenciación electroforética o la electroforesis capilar han tenido éxito en el análisis de huellas de fragmentos marcados con fluorescencia. [2]
Se puede elegir una variedad de agentes de escisión. Un agente deseable es uno que sea neutral en cuanto a la secuencia, fácil de usar y fácil de controlar. Desafortunadamente, ningún agente disponible cumple con todos estos estándares, por lo que se puede elegir un agente apropiado, dependiendo de su secuencia de ADN y ligando de interés. Los siguientes agentes de escisión se describen en detalle: La ADNasa I es una proteína grande que funciona como una endonucleasa de doble cadena . Se une al surco menor del ADN y escinde la cadena principal de fosfodiéster. Es un buen agente de escisión para la huella porque su tamaño hace que sea fácilmente obstaculizado físicamente. Por lo tanto, es más probable que su acción sea bloqueada por una proteína unida en una secuencia de ADN. Además, la enzima ADNasa I se controla fácilmente agregando EDTA para detener la reacción. Sin embargo, existen algunas limitaciones en el uso de la ADNasa I. La enzima no corta el ADN al azar; su actividad se ve afectada por la estructura y secuencia del ADN local y, por lo tanto, da como resultado una escalera desigual. Esto puede limitar la precisión de predecir el sitio de unión de una proteína en la molécula de ADN. [2] [3] Los radicales hidroxilo se crean a partir de la reacción de Fenton , que implica la reducción de Fe2 + con H2O2 para formar moléculas de hidroxilo libres. Estas moléculas de hidroxilo reaccionan con la cadena principal del ADN, lo que resulta en una rotura. Debido a su pequeño tamaño, la huella de ADN resultante tiene una alta resolución. A diferencia de la DNasa I, no tienen dependencia de la secuencia y dan como resultado una escalera distribuida mucho más uniformemente. El aspecto negativo de usar radicales hidroxilo es que su uso requiere más tiempo, debido a un tiempo de reacción y digestión más lento. [4] La irradiación ultravioleta se puede utilizar para excitar ácidos nucleicos y crear fotorreacciones, lo que da como resultado bases dañadas en la cadena de ADN. [5] Las fotorreacciones pueden incluir: roturas de una sola cadena, interacciones entre o dentro de las cadenas de ADN, reacciones con solventes o enlaces cruzados con proteínas. El flujo de trabajo para este método tiene un paso adicional, una vez que se han tratado tanto el ADN protegido como el no protegido, hay una extensión posterior del cebador de los productos escindidos. [6] [7] La extensión terminará al alcanzar una base dañada y, por lo tanto, cuando los productos de PCR se ejecuten uno al lado del otro en un gel, la muestra protegida mostrará una banda adicional donde el ADN se entrecruzó con una proteína unida. Las ventajas de usar UV son que reacciona muy rápidamente y, por lo tanto, puede capturar interacciones que son solo momentáneas. Además, se puede aplicar in vivoExperimentos con luz ultravioleta, ya que la luz ultravioleta puede penetrar las membranas celulares. Una desventaja es que el gel puede ser difícil de interpretar, ya que la proteína unida no protege el ADN, sino que simplemente altera las fotorreacciones en las proximidades. [8]
La huella in vivo es una técnica utilizada para analizar las interacciones proteína-ADN que se producen en una célula en un momento dado. [9] [10] La DNasa I se puede utilizar como agente de escisión si la membrana celular se ha permeabilizado. Sin embargo, el agente de escisión más común utilizado es la irradiación UV porque penetra la membrana celular sin alterar el estado celular y, por tanto, puede capturar interacciones que son sensibles a los cambios celulares. Una vez que el ADN se ha escindido o dañado por los rayos UV, las células se pueden lisar y el ADN se puede purificar para el análisis de una región de interés. La PCR mediada por ligación es un método alternativo a la huella in vivo . Una vez que se ha utilizado un agente de escisión en el ADN genómico, lo que da como resultado roturas de una sola cadena, y se aísla el ADN, se añade un enlazador en los puntos de rotura. Se amplifica una región de interés entre el enlazador y un cebador específico del gen y, cuando se ejecuta en un gel de poliacrilamida, tendrá una huella donde se unió una proteína. [11] La técnica de huella de ADN in vivo combinada con inmunoprecipitación se puede utilizar para evaluar la especificidad de las proteínas en muchas ubicaciones a lo largo del genoma. El ADN unido a una proteína de interés se puede inmunoprecipitar con un anticuerpo para esa proteína y luego se puede evaluar la unión a una región específica utilizando la técnica de huella de ADN. [12]
La técnica de la huella de ADN se puede modificar para evaluar la fuerza de unión de una proteína a una región de ADN. Utilizando concentraciones variables de la proteína para el experimento de huella, se puede observar la apariencia de la huella a medida que aumentan las concentraciones y luego se puede estimar la afinidad de unión de las proteínas. [2]
Para adaptar la técnica de huellas dactilares a los métodos de detección actualizados, los fragmentos de ADN marcados se detectan mediante un dispositivo de electroforesis capilar en lugar de pasarlos por un gel de poliacrilamida. Si el fragmento de ADN que se va a analizar se produce mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es sencillo acoplar una molécula fluorescente como la carboxifluoresceína (FAM) a los cebadores. De esta manera, los fragmentos producidos por la digestión con DNasa I contendrán FAM y serán detectables por la máquina de electroforesis capilar. Por lo general, también se añaden estándares de tamaño marcados con carboxitetrametil-rodamina (ROX) a la mezcla de fragmentos que se van a analizar. De esta manera se han identificado con éxito los sitios de unión de los factores de transcripción. [13]
La secuenciación de próxima generación ha permitido un enfoque de todo el genoma para identificar huellas de ADN. Los ensayos de cromatina abiertos como DNase-Seq [14] y FAIRE-Seq [15] han demostrado proporcionar un marco regulatorio sólido para muchos tipos de células. [16] Sin embargo, estos ensayos requieren algunos análisis bioinformáticos posteriores para proporcionar huellas de ADN de todo el genoma. Las herramientas computacionales propuestas se pueden clasificar en dos clases: enfoques basados en la segmentación y enfoques centrados en el sitio.
Los métodos basados en la segmentación se basan en la aplicación de modelos de Markov ocultos o métodos de ventana deslizante para segmentar el genoma en regiones de cromatina abiertas/cerradas. Ejemplos de tales métodos son: HINT, [17] método de Boyle [18] y método Neph. [19] Los métodos centrados en el sitio, por otro lado, encuentran huellas dado el perfil de cromatina abierta alrededor de los sitios de unión predichos por el motivo, es decir, regiones reguladoras predichas utilizando información de secuencia de proteína-ADN (codificada en estructuras como la matriz de peso de posición ). Ejemplos de estos métodos son CENTIPEDE [20] y el método Cuellar-Partida. [21]