La promiscuidad enzimática es la capacidad de una enzima de catalizar una reacción secundaria inesperada además de su reacción principal. Aunque las enzimas son catalizadores notablemente específicos, a menudo pueden realizar reacciones secundarias además de su actividad catalítica nativa principal. Estas actividades salvajes suelen ser lentas en relación con la actividad principal y están bajo selección neutral. A pesar de que normalmente son fisiológicamente irrelevantes, bajo nuevas presiones selectivas, estas actividades pueden conferir un beneficio de aptitud, lo que impulsa la evolución de la actividad anteriormente promiscua para convertirse en la nueva actividad principal. [1] Un ejemplo de esto es la atrazina clorohidrolasa ( codificada por atzA ) de Pseudomonas sp. La ADP evolucionó a partir de la melamina desaminasa ( codificada por triA ), que tiene una actividad promiscua muy pequeña hacia la atrazina, una sustancia química artificial. [2]
Las enzimas evolucionan para catalizar una reacción particular en un sustrato particular con alta eficiencia catalítica ( k cat / K M , cf . cinética de Michaelis–Menten ). Sin embargo, además de esta actividad principal, poseen otras actividades que son generalmente varios órdenes de magnitud menores, y que no son resultado de la selección evolutiva y, por lo tanto, no participan en la fisiología del organismo. [nb 1] Este fenómeno permite obtener nuevas funciones, ya que la actividad promiscua podría conferir un beneficio de aptitud bajo una nueva presión selectiva que conduce a su duplicación y selección como una nueva actividad principal.
Existen varios modelos teóricos para predecir el orden de los eventos de duplicación y especialización, pero el proceso real es más entrelazado y difuso (§ Enzimas reconstruidas a continuación). [3] Por un lado, la amplificación genética produce un aumento en la concentración de enzimas y, potencialmente, la liberación de una regulación restrictiva, lo que aumenta la velocidad de reacción ( v ) de la actividad promiscua de la enzima, lo que hace que sus efectos sean más pronunciados fisiológicamente ("efecto de la dosis genética"). [4] Por otro lado, las enzimas pueden desarrollar una mayor actividad secundaria con poca pérdida de la actividad primaria ("robustez") con poco conflicto adaptativo (§ Robustez y plasticidad a continuación). [5]
Un estudio de cuatro hidrolasas distintas (paraoxonasa sérica humana (PON1), fosfotriesterasa de pseudomonas (PTE), fosfatasa de tirosina proteica (PTP) y anhidrasa carbónica II humana (CAII)) ha demostrado que la actividad principal es "robusta" frente al cambio, mientras que las actividades promiscuas son débiles y más "plásticas". En concreto, la selección de una actividad que no es la principal (mediante la evolución dirigida ) no disminuye inicialmente la actividad principal (de ahí su robustez), pero afecta en gran medida a las actividades no seleccionadas (de ahí su plasticidad). [5]
La fosfotriesterasa (PTE) de Pseudomonas diminuta evolucionó para convertirse en una arilesterasa (hidrolasa de P–O a C–O) en dieciocho rondas, obteniendo un cambio de 10 9 en especificidad (ratio de K M ), sin embargo, la mayor parte del cambio ocurrió en las rondas iniciales, donde se mantuvo la actividad vestigial de PTE no seleccionada y la actividad de arilesterasa evolucionada creció, mientras que en las últimas rondas hubo una pequeña compensación por la pérdida de la actividad vestigial de PTE a favor de la actividad de arilesterasa. [6]
Esto significa, en primer lugar, que una enzima especializada (monofuncional), cuando evoluciona, pasa por una etapa generalista (multifuncional), antes de volverse especialista nuevamente (presumiblemente después de la duplicación genética según el modelo IAD) y, en segundo lugar, que las actividades promiscuas son más plásticas que la actividad principal.
El ejemplo más reciente y claro de evolución enzimática es el surgimiento de las enzimas biorremediadoras en los últimos 60 años. Debido al número muy bajo de cambios de aminoácidos, estas proporcionan un modelo excelente para investigar la evolución enzimática en la naturaleza. Sin embargo, el uso de enzimas existentes para determinar cómo evolucionó la familia de enzimas tiene el inconveniente de que la enzima recién evolucionada se compara con parálogas sin conocer la verdadera identidad del ancestro antes de que los dos genes divergieran. Este problema se puede resolver gracias a la reconstrucción ancestral. Propuesta por primera vez en 1963 por Linus Pauling y Emile Zuckerkandl, la reconstrucción ancestral es la inferencia y síntesis de un gen a partir de la forma ancestral de un grupo de genes, [7] que ha tenido un resurgimiento reciente gracias a técnicas de inferencia mejoradas [8] y síntesis genética artificial de bajo costo [9] , lo que ha dado como resultado varias enzimas ancestrales, apodadas "enzimas madre" por algunos [10] , para ser estudiadas. [11]
La evidencia obtenida a partir de la enzima reconstruida sugiere que el orden de los eventos donde se mejora la nueva actividad y se duplica el gen no es claro, a diferencia de lo que sugieren los modelos teóricos de la evolución genética.
Un estudio mostró que el gen ancestral de la familia de proteasas de defensa inmune en mamíferos tenía una especificidad más amplia y una eficiencia catalítica más alta que la familia contemporánea de parálogos, [10] mientras que otro estudio mostró que el receptor de esteroides ancestral de los vertebrados era un receptor de estrógeno con una ligera ambigüedad de sustrato para otras hormonas, lo que indica que probablemente estas no se sintetizaron en ese momento. [12]
Esta variabilidad en la especificidad ancestral no solo se ha observado entre diferentes genes, sino también dentro de la misma familia de genes. En vista de la gran cantidad de genes de α-glucosidasa fúngica parálogos con varios sustratos específicos similares a la maltosa (maltosa, turanosa, maltotriosa, maltulosa y sacarosa) y similares a la isomaltosa (isomaltosa y palatinosa), un estudio reconstruyó todos los ancestros clave y descubrió que el último ancestro común de los parálogos era principalmente activo en sustratos similares a la maltosa con solo actividad traza para azúcares similares a la isomaltosa, a pesar de conducir a un linaje de glucosidasas de iso-maltosa y un linaje que luego se dividió en glucosidasas de maltosa y glucosidasas de iso-maltosa. Antitéticamente, el ancestro anterior a la última división tenía una actividad de glucosidasa similar a la isomaltosa más pronunciada. [3]
En 1976, Roy Jensen teorizó que las enzimas primordiales tenían que ser altamente promiscuas para que las redes metabólicas se ensamblaran de manera irregular (de ahí su nombre, el modelo de mosaico ). Esta versatilidad catalítica primordial se perdió más tarde en favor de enzimas ortólogas especializadas altamente catalíticas. [13] Como consecuencia, muchas enzimas metabólicas centrales tienen homólogos estructurales que divergieron antes del último ancestro común universal . [14]
La promiscuidad no es solo un primer rasgo, sino también una propiedad muy extendida en los genomas modernos. Se han realizado una serie de experimentos para evaluar la distribución de actividades enzimáticas promiscuas en E. coli . En E. coli, 21 de 104 knockouts de un solo gen probados (de la colección Keio [15] ) podrían rescatarse sobreexpresando una proteína de E. coli no cognada (utilizando un conjunto agrupado de plásmidos de la colección ASKA [16] ). Los mecanismos por los cuales el ORF no cognado podría rescatar el knockout se pueden agrupar en ocho categorías: sobreexpresión de isozimas (homólogos), ambigüedad de sustrato, ambigüedad de transporte (eliminación), promiscuidad catalítica, mantenimiento del flujo metabólico (incluida la sobreexpresión del componente grande de una sintasa en ausencia de la subunidad amino transferasa), derivación de la vía, efectos reguladores y mecanismos desconocidos. [4] De manera similar, la sobreexpresión de la colección ORF permitió a E. coli ganar más de un orden de magnitud en resistencia en 86 de 237 ambientes tóxicos. [17]
A veces se sabe que los homólogos muestran promiscuidad hacia las reacciones principales de los demás. [18] Esta promiscuidad cruzada ha sido más estudiada con miembros de la superfamilia de la fosfatasa alcalina , que cataliza la reacción hidrolítica en el enlace éster sulfato, fosfonato, monofosfato, difosfato o trifosfato de varios compuestos. [19] A pesar de la separación, los homólogos tienen un grado variable de promiscuidad recíproca: las diferencias en la promiscuidad se deben a los mecanismos involucrados, particularmente al intermediario requerido. [19]
Las enzimas generalmente se encuentran en un estado que no solo es un compromiso entre estabilidad y eficiencia catalítica, sino también para especificidad y capacidad de evolución, las últimas dos dictan si una enzima es generalista (altamente evolutiva debido a la gran promiscuidad, pero baja actividad principal) o especialista (alta actividad principal, poco evolutiva debido a la baja promiscuidad). [20] Ejemplos de estos son las enzimas para el metabolismo primario y secundario en plantas (§ Metabolismo secundario de plantas a continuación). Otros factores pueden entrar en juego, por ejemplo, la glicerofosfodiesterasa ( gpdQ ) de Enterobacter aerogenes muestra diferentes valores para sus actividades promiscuas dependiendo de los dos iones metálicos a los que se une, lo que está dictado por la disponibilidad de iones. [21] En algunos casos, la promiscuidad se puede aumentar relajando la especificidad del sitio activo agrandándolo con una única mutación, como fue el caso de un mutante D297G de la epimerasa L-Ala-D/L-Glu de E. coli ( ycjG ) y un mutante E323G de una enzima lactonizante de muconato de pseudomonad II, lo que les permitió catalizar promiscuamente la actividad de la sintasa de O-succinilbenzoato ( menC ). [22] Por el contrario, la promiscuidad se puede disminuir, como fue el caso de la sintasa de γ-humuleno (una sintasa de sesquiterpeno) de Abies grandis , que se sabe que produce 52 sesquiterpenos diferentes a partir de difosfato de farnesilo tras varias mutaciones. [23]
Estudios sobre enzimas con amplia especificidad (no promiscuas, pero conceptualmente cercanas), como la tripsina y la quimotripsina de mamíferos y la isopropilmalato isomerasa/homoaconitasa bifuncional de Pyrococcus horikoshii, han revelado que la movilidad del bucle del sitio activo contribuye sustancialmente a la elasticidad catalítica de la enzima. [24] [25]
Una actividad promiscua es una actividad no nativa que la enzima no evolucionó para hacer, sino que surge debido a una conformación acomodaticia del sitio activo. Sin embargo, la actividad principal de la enzima es el resultado no solo de la selección hacia una alta tasa catalítica hacia un sustrato particular para producir un producto particular, sino también para evitar la producción de productos tóxicos o innecesarios. [1] Por ejemplo, si una síntesis de ARNt cargó un aminoácido incorrecto en un ARNt, el péptido resultante tendría propiedades inesperadamente alteradas, en consecuencia, para mejorar la fidelidad están presentes varios dominios adicionales. [26] De manera similar a la reacción a la síntesis de ARNt, la primera subunidad de la tirocidina sintetasa ( tyrA ) de Bacillus brevis adenila una molécula de fenilalanina para usar la fracción adenilo como un asa para producir tirocidina , un péptido cíclico no ribosomal . Cuando se investigó la especificidad de la enzima, se encontró que era altamente selectiva contra los aminoácidos naturales que no eran fenilalanina, pero era mucho más tolerante hacia los aminoácidos no naturales. [27] Específicamente, la mayoría de los aminoácidos no fueron catalizados, mientras que el siguiente aminoácido nativo más catalizado fue la tirosina estructuralmente similar, pero en una milésima parte tanto como la fenilalanina, mientras que varios aminoácidos no naturales fueron catalizados mejor que la tirosina, a saber, D-fenilalanina, β-ciclohexil-L-alanina, 4-amino-L-fenilalanina y L-norleucina. [27]
Un caso particular de actividad secundaria seleccionada son las polimerasas y las endonucleasas de restricción, donde la actividad incorrecta es en realidad el resultado de un compromiso entre la fidelidad y la capacidad de evolución. Por ejemplo, en el caso de las endonucleasas de restricción, la actividad incorrecta ( actividad estrella ) suele ser letal para el organismo, pero una pequeña cantidad permite que se desarrollen nuevas funciones contra nuevos patógenos. [28]
Las plantas producen una gran cantidad de metabolitos secundarios gracias a enzimas que, a diferencia de las que intervienen en el metabolismo primario, son menos eficientes catalíticamente pero tienen una mayor elasticidad mecanística (tipos de reacción) y especificidades más amplias. El umbral de deriva liberal (causado por la baja presión selectiva debido al pequeño tamaño de la población) permite que la ganancia de aptitud otorgada por uno de los productos mantenga las otras actividades aunque puedan ser fisiológicamente inútiles. [29]
En biocatálisis se buscan muchas reacciones que no existen en la naturaleza. Para ello se identifican enzimas con una pequeña actividad promiscua hacia la reacción requerida y se desarrollan mediante evolución dirigida o diseño racional . [30]
Un ejemplo de una enzima comúnmente evolucionada es la ω-transaminasa , que puede reemplazar una cetona con una amina quiral [31] y, en consecuencia, existen bibliotecas de diferentes homólogos disponibles comercialmente para una biominería rápida ( por ejemplo, Codexis [32] ).
Otro ejemplo es la posibilidad de utilizar las actividades promiscuas de la cisteína sintasa ( cysM ) hacia los nucleófilos para producir aminoácidos no proteinogénicos . [33]
La similitud entre reacciones enzimáticas (CE) se puede calcular utilizando cambios de enlace, centros de reacción o métricas de subestructura (EC-BLAST Archivado el 30 de mayo de 2019 en Wayback Machine ). [34]
Mientras que la promiscuidad se estudia principalmente en términos de cinética enzimática estándar, la unión del fármaco y la reacción posterior es una actividad promiscua ya que la enzima cataliza una reacción inactivadora hacia un nuevo sustrato que no evolucionó para catalizar. [5] Esto podría deberse a la demostración de que solo hay una pequeña cantidad de bolsillos de unión de ligando distintos en las proteínas.
Por otra parte, el metabolismo xenobiótico de los mamíferos evolucionó para tener una amplia especificidad para oxidar, unir y eliminar compuestos lipofílicos extraños que pueden ser tóxicos, como los alcaloides vegetales, por lo que su capacidad para desintoxicar xenobióticos antropogénicos es una extensión de esto. [35]