El proceso Cohn , desarrollado por Edwin J. Cohn , es una serie de pasos de purificación con el propósito de extraer albúmina del plasma sanguíneo . El proceso se basa en la solubilidad diferencial de la albúmina y otras proteínas plasmáticas en función del pH , la concentración de etanol , la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de proteínas. [1] [2] La albúmina tiene la mayor solubilidad y el punto isoeléctrico más bajo de todas las principales proteínas plasmáticas. Esto la convierte en el producto final que se precipita o se separa de su solución en forma sólida. La albúmina fue un excelente sustituto del plasma humano en la Segunda Guerra Mundial. Cuando se administraba a soldados heridos u otros pacientes con pérdida de sangre, ayudaba a expandir el volumen de sangre y conducía a una recuperación más rápida. El método de Cohn era lo suficientemente suave como para que la proteína albúmina aislada conservara su actividad biológica . [3]
Durante las operaciones, la concentración de etanol cambia de cero inicialmente a 40%. El pH disminuye de neutro a 7 a más ácido a 4,8 durante el fraccionamiento. La temperatura comienza a temperatura ambiente y disminuye a -5 grados Celsius. Inicialmente, la sangre se congela. Hay cinco fracciones principales. Cada fracción termina con un precipitado específico. Estos precipitados son las fracciones separadas. [4]
Las fracciones I, II y III se precipitan en etapas anteriores. Las condiciones de las etapas anteriores son 8% de etanol, pH 7,2, -3 °C y 5,1% de proteína para la fracción I; 25% de etanol, pH 6,9, -5 °C y 3% de proteína. La albúmina permanece en la fracción sobrenadante durante la separación sólido/líquido en estas condiciones. La fracción IV tiene varias proteínas no deseadas que deben eliminarse. Para ello, se varían las condiciones para precipitar las proteínas. Las condiciones para precipitar estas proteínas son aumentar la concentración de etanol del 18 al 40% y aumentar el pH de 5,2 a 5,8. Finalmente, la albúmina se encuentra en la fracción V. La precipitación de la albúmina se realiza reduciendo el pH a 4,8, que está cerca del pI de la proteína, y manteniendo la concentración de etanol en un 40%, con una concentración de proteína del 1%. De esta forma, sólo el 1% del plasma original permanece en la quinta fracción. [4]
Sin embargo, la albúmina se pierde en cada etapa del proceso, con aproximadamente el 20% de la albúmina perdida a través de etapas de precipitación antes de la fracción V. Para purificar la albúmina, hay una extracción con agua y ajuste a etanol al 10%, pH de 4,5 a -3 °C. Cualquier precipitado formado aquí se hace por filtración y es una impureza. Estos precipitados se descartan. La reprecipitación, o repetición del paso de precipitación para mejorar la pureza, se hace aumentando la concentración de etanol de nuevo al 40% desde la etapa de extracción. El pH es 5,2 y se lleva a cabo a -5 °C. Se crearon varias variaciones de la fracción de Cohn para tener en cuenta el menor costo y el mayor rendimiento. Generalmente, si el rendimiento es alto, la pureza se reduce a aproximadamente el 85-90%. [4]
Cohn pudo poner en marcha el Laboratorio de Fraccionamiento de Plasma después de que las agencias gubernamentales y las compañías farmacéuticas privadas le dieran una financiación masiva. Esto condujo al fraccionamiento de plasma humano. El plasma humano demostró tener varios componentes útiles además de la albúmina. El fraccionamiento de plasma sanguíneo humano produjo albúmina sérica humana , gammaglobulina sérica , fibrinógeno , trombina y globulinas del grupo sanguíneo. [5] Las fracciones de fibrinógeno y trombina se combinaron aún más durante la guerra en productos adicionales, incluido el sellador de fibrina líquida , [6] espuma de fibrina sólida y una película de fibrina. [7] Las gammaglobulinas se encuentran en las Fracciones II y III y demostraron ser esenciales en el tratamiento del sarampión para los soldados. La gammaglobulina también fue útil en el tratamiento de la polio, pero no tuvo mucho efecto en el tratamiento de las paperas o la escarlatina. Lo más importante es que las gammaglobulinas fueron útiles para modificar y prevenir la hepatitis infecciosa durante la Segunda Guerra Mundial. Finalmente se convirtió en un tratamiento para los niños expuestos a este tipo de hepatitis. [5]
El sellador de fibrina líquida se utilizó para tratar a las víctimas de quemaduras, incluidas algunas del ataque a Pearl Harbor, para unir injertos de piel con una mayor tasa de éxito. [6] También se encontró que era útil para reconectar o anastomosar nervios cortados. [6] La espuma de fibrina y la trombina se utilizaron para controlar la supuración de los vasos sanguíneos, especialmente en lesiones hepáticas y cerca de tumores. También minimizaba el sangrado de las venas grandes y trataba las malformaciones de los vasos sanguíneos dentro del cerebro. La película de fibrina se utilizó para detener el sangrado en varias aplicaciones quirúrgicas, incluida la neurocirugía. [6] Sin embargo, no fue útil para controlar el sangrado arterial. [5] El primer producto a base de fibrinógeno/fibrina capaz de detener la hemorragia arterial fue el "vendaje sellador de fibrina" o "apósito hemostático (HD)" inventado por Martin MacPhee en la Cruz Roja Americana a principios de la década de 1990 y probado en colaboración con el Ejército de los EE. UU. [8] [9]
El método Gerlough, desarrollado en 1955, mejoró la economía del proceso al reducir el consumo de etanol. En lugar de un 40 % en ciertos pasos, Gerlough utilizó un 20 % de etanol para la precipitación. Esto se utiliza especialmente para las fracciones II y III. Además, Gerlough combinó las dos fracciones con IV en un solo paso para reducir el número de fraccionamientos necesarios. Si bien este método resultó menos costoso, no fue adoptado por la industria debido a esta combinación de fracciones II, III y IV, por temor a la mezcla y a las altas impurezas. [10]
El método Hink, desarrollado en 1957, permitió obtener mayores rendimientos gracias a la recuperación de algunas de las proteínas plasmáticas descartadas en las fracciones de IV. Sin embargo, los mejores rendimientos se compensaron con las menores purezas obtenidas, dentro del rango del 85%. [10]
El método Mulford, similar al de Hink, utilizaba el sobrenadante de las fracciones II y III como último paso antes del acabado y el tratamiento térmico. El método combinaba las fracciones IV y V, pero en este caso la albúmina no sería tan pura, aunque los rendimientos podrían ser mayores. [10]
Kistler y Nitschmann desarrollaron otra variación para proporcionar una forma más pura de albúmina, aunque compensada por rendimientos más bajos. De manera similar a Gerlough, el Precipitado A, que es equivalente a la Fracción II y III de Cohn, se realizó a una concentración de etanol más baja del 19%, pero el pH, en este caso, también fue menor a 5,85. También similar a Gerlough y Mulford, la fracción IV se combinó y precipitó en condiciones de 40% de etanol, pH de 5,85 y temperatura de -8 grados C. La albúmina, que se recupera en la fracción V, se recupera en el Precipitado C con un ajuste de pH de 4,8. De manera similar al Proceso Cohn, la albúmina se purifica mediante extracción en agua seguida de precipitación de las impurezas al 10% de etanol, pH 4,6 y -3 grados C. Similar al Proceso Cohn, el precipitado formado aquí se filtra y se descarta. Luego, el precipitado C (fracción V) se reprecipita a pH 5,2 y se almacena como una pasta a -40 grados C. [10] Este proceso ha sido más ampliamente aceptado porque separa las fracciones y hace que cada etapa sea independiente de las demás.
Otra variante implicaba un fraccionamiento de etanol por calor. Se desarrolló originalmente para inactivar el virus de la hepatitis. En este proceso, la recuperación de albúmina de alto rendimiento y alta pureza es el objetivo más importante, mientras que las otras proteínas plasmáticas se descuidan. Para asegurarse de que la albúmina no se desnaturalice con el calor, existen estabilizadores como el octanoato de sodio, que permiten que la albúmina tolere temperaturas más altas durante períodos prolongados. En el etanol por calor, el plasma se trata térmicamente a 68 grados C con octanoato de sodio con etanol al 9% a un pH de 6,5. Esto da como resultado una recuperación de albúmina mejorada con rendimientos del 90% y purezas del 100%. No es tan caro como los procedimientos de etanol frío como el Proceso Cohn. Un inconveniente es la presencia de nuevos antígenos debido a la posible desnaturalización térmica de la albúmina. Además, las otras proteínas plasmáticas tienen usos prácticos y no valdría la pena descuidarlas. Finalmente, los costosos recipientes de tratamiento térmico compensan el menor costo en comparación con el formato de etanol frío que no lo necesita. Por estas razones, varias empresas no han adoptado este método a pesar de que ofrece los resultados más impresionantes. Sin embargo, una organización destacada que lo utiliza es la Cruz Roja Alemana. [10]
La última variación fue desarrollada por Hao en 1979. Este método es significativamente más simple en comparación con el Proceso Cohn. Su objetivo es crear altos rendimientos de albúmina siempre que la albúmina sea el único producto. A través de un proceso de dos etapas, las impurezas se precipitan directamente del sobrenadante de las fracciones II y III con 42% de etanol, pH 5,8, temperatura de -5 grados C, 1,2% de proteína y fuerza iónica de 0,09. La fracción V se precipita a pH 4,8. Las fracciones I, II, III y IV se coprecipitan con 40% de etanol, con un pH de 5,4 a 7,0 y una temperatura de -3 a -7 grados C. Luego, la fracción V se precipita a pH 4,8 y -10 grados C. Los altos rendimientos se deben a una combinación de un proceso simplificado, con menores pérdidas debido a la coprecipitación y el uso de filtración. También se lograron purezas más altas, del 98 %, debido a los niveles más altos de etanol, pero los rendimientos se redujeron con la alta pureza. [10]
Los métodos más recientes implican el uso de cromatografía . [11]
El proceso Cohn fue un gran avance en el campo del fraccionamiento de la sangre. Tiene varios usos prácticos en el tratamiento de enfermedades como la hepatitis y la polio. Fue muy útil durante la Segunda Guerra Mundial, donde los soldados se recuperaban a un ritmo más rápido gracias a las transfusiones de albúmina. El proceso Cohn se ha modificado a lo largo de los años, como se ve arriba. Además, ha influido en otros procesos de la industria del fraccionamiento de la sangre. Esto ha dado lugar a nuevas formas de fraccionamiento, como el fraccionamiento de plasma cromatográfico en procesos de intercambio iónico y de acabado de albúmina. En general, el proceso Cohn y sus variaciones han dado un gran impulso y sirven de base a la industria del fraccionamiento hasta el día de hoy. [12]
Sin embargo, el proceso no se ha estudiado bien porque es arcaico. Lo más importante es que nunca ha sido modernizado por las empresas manufactureras. El formato de etanol frío puede ser demasiado suave para matar ciertos virus que requieren inactivación por calor. Dado que este proceso permanece sin cambios durante tanto tiempo, varias ineficiencias e inconsistencias incorporadas afectan la economía del proceso para las empresas farmacéuticas y manufactureras. [12] Una excepción a esto fue la aplicación en Escocia del procesamiento de flujo continuo en lugar del procesamiento por lotes. Este proceso fue ideado en el Centro de Fraccionamiento de Proteínas (PFC), la instalación de fraccionamiento de plasma del Servicio Nacional de Transfusión de Sangre de Escocia (SNBTS). Este proceso implicó la monitorización y el control en línea del pH y la temperatura, con control de flujo de corrientes de plasma y etanol utilizando bombas de engranajes de precisión, todo bajo control de retroalimentación computarizado. Como resultado, las Fracciones de Cohn I + II + III, IV y V se produjeron en unas pocas horas, en lugar de durante muchos días. La preparación de flujo continuo de crioprecipitado se integró posteriormente en el proceso aguas arriba del Fraccionamiento de Cohn. [13]
Sin embargo, este proceso sigue siendo una base fundamental para la industria de la sangre en general y su influencia se puede ver en el desarrollo de métodos más nuevos, ya que se hace referencia a él. Aunque tiene sus inconvenientes según la variación, la principal ventaja del proceso Cohn es su uso práctico y su utilidad dentro de las industrias farmacológica y médica. [ cita requerida ]