Un dímero de cebador ( PD ) es un subproducto potencial en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método biotecnológico común. Como su nombre lo indica, un PD consiste en dos moléculas de cebador que se han unido ( hibridado ) entre sí debido a cadenas de bases complementarias en los cebadores. Como resultado, la ADN polimerasa amplifica el PD, lo que genera competencia por los reactivos de PCR, inhibiendo así potencialmente la amplificación de la secuencia de ADN objetivo para la amplificación por PCR. En la PCR cuantitativa , los PD pueden interferir con la cuantificación precisa.
Un dímero de cebadores se forma y se amplifica en tres pasos. En el primer paso, dos cebadores se unen en sus respectivos extremos 3' (paso I en la figura). Si este constructo es lo suficientemente estable, la ADN polimerasa se unirá y extenderá los cebadores de acuerdo con la secuencia complementaria (paso II en la figura). Un factor importante que contribuye a la estabilidad del constructo en el paso I es un alto contenido de GC en los extremos 3' y la longitud de la superposición. El tercer paso ocurre en el siguiente ciclo, cuando se utiliza una sola hebra del producto del paso II como plantilla a la que se unen cebadores nuevos, lo que conduce a la síntesis de más producto de PD. [1]
Los dímeros de cebadores pueden ser visibles después de la electroforesis en gel del producto de PCR. Los PD en geles teñidos con bromuro de etidio se ven típicamente como una banda o mancha de 30 a 50 pares de bases (pb) de intensidad moderada a alta y distinguible de la banda de la secuencia objetivo, que típicamente es más larga que 50 pb.
En la PCR cuantitativa , los PD pueden detectarse mediante el análisis de la curva de fusión con colorantes intercalantes, como SYBR Green I , un colorante no específico para la detección de ADN bicatenario. Debido a que generalmente consisten en secuencias cortas, los PD se desnaturalizan a una temperatura más baja que la secuencia objetivo y, por lo tanto, se pueden distinguir por las características de su curva de fusión.
Un enfoque para prevenir los PD consiste en la optimización físico-química del sistema de PCR, es decir, cambiar las concentraciones de cebadores, cloruro de magnesio , nucleótidos , fuerza iónica y temperatura de la reacción. Este método está algo limitado por las características físico-químicas que también determinan la eficiencia de la amplificación de la secuencia diana en la PCR. Por lo tanto, la reducción de la formación de PD también puede resultar en una eficiencia reducida de la PCR. Para superar esta limitación, otros métodos apuntan a reducir la formación de PD únicamente, incluido el diseño de cebadores y el uso de diferentes sistemas enzimáticos o reactivos de PCR. [ cita requerida ]
El software de diseño de cebadores utiliza algoritmos que comprueban la posibilidad de formación de estructuras secundarias del ADN y la hibridación de los cebadores consigo mismos o dentro de pares de cebadores. Los parámetros físicos que tiene en cuenta el software son la posible autocomplementariedad y el contenido de GC de los cebadores; las temperaturas de fusión similares de los cebadores; y la ausencia de estructuras secundarias, como los bucles de tallo , en la secuencia de ADN diana. [2]
Debido a que los cebadores están diseñados para tener baja complementariedad entre sí, pueden annealing (paso I en la figura) solo a baja temperatura, por ejemplo, temperatura ambiente, como durante la preparación de la mezcla de reacción. Aunque las ADN polimerasas utilizadas en PCR son más activas alrededor de 70 °C, también tienen cierta actividad polimerizante a temperaturas más bajas, lo que puede causar la síntesis de ADN a partir de los cebadores después de annealing entre sí. [3] Se han desarrollado varios métodos para prevenir la formación de PD hasta que la reacción alcanza la temperatura de trabajo (60-70 °C), y estos incluyen la inhibición inicial de la ADN polimerasa o la separación física de la reacción de los componentes hasta que la mezcla de reacción alcanza las temperaturas más altas. Estos métodos se conocen como PCR de inicio en caliente .
Cera : en este método, la enzima se separa espacialmente de la mezcla de reacción mediante cera que se derrite cuando la reacción alcanza una temperatura alta. [4]
Liberación lenta de magnesio : la ADN polimerasa requiere iones de magnesio para su actividad, [5] por lo que el magnesio se separa químicamente de la reacción al unirse a un compuesto químico y se libera en la solución solo a alta temperatura [6].
Unión no covalente del inhibidor : en este método, un péptido , anticuerpo [7] o aptámero [8] se unen de forma no covalente a la enzima a baja temperatura e inhiben su actividad. Después de una incubación de 1 a 5 minutos a 95 °C, se libera el inhibidor y comienza la reacción.
Polimerasa Taq sensible al frío : es una ADN polimerasa modificada con casi ninguna actividad a baja temperatura. [9]
Modificación química : en este método, una molécula pequeña se une covalentemente a la cadena lateral de un aminoácido en el sitio activo de la ADN polimerasa. La molécula pequeña se libera de la enzima mediante la incubación de la mezcla de reacción durante 10 a 15 minutos a 95 °C. Una vez que se libera la molécula pequeña, la enzima se activa. [10]
Otro enfoque para prevenir o reducir la formación de PD es modificar los cebadores para que el alineamiento entre ellos mismos o entre ellos no provoque extensión.
HANDS ( Sistema no dimer asistido por homoetiqueta [ 11] ): se añade una cola de nucleótidos, complementaria al extremo 3' del cebador, al extremo 5' del cebador. Debido a la proximidad de la cola 5', se une al extremo 3' del cebador. El resultado es un cebador de tallo -bucle que excluye el annealing que implica superposiciones más cortas, pero permite el annealing del cebador a su secuencia totalmente complementaria en el objetivo.
Cebadores quiméricos : algunas bases de ADN en el cebador se reemplazan con bases de ARN, creando una secuencia quimérica . La temperatura de fusión de una secuencia quimérica con otra secuencia quimérica es menor que la de una secuencia quimérica con ADN. Esta diferencia permite establecer la temperatura de hibridación de manera que el cebador se hibride con su secuencia objetivo, pero no con otros cebadores quiméricos. [12]
Cebadores escindibles por bloqueo : un método conocido como PCR dependiente de la ARNasa H (rhPCR), [13] utiliza una ARNasa HII termoestable para eliminar un grupo de bloqueo de los cebadores de PCR a alta temperatura. Esta enzima ARNasa HII casi no muestra actividad a baja temperatura, por lo que la eliminación del bloqueo solo ocurre a alta temperatura. La enzima también posee una discriminación inherente de desajustes entre cebadores y moldes, lo que resulta en una selección adicional contra los dímeros de cebadores.
Sistemas de reconocimiento molecular autoevitativos : también conocidos como SAMRS, [14] eliminan los dímeros de cebadores al introducir los análogos de nucleótidos T*, A*, G* y C* en el cebador. El ADN de SAMRS podría unirse al ADN natural, pero no a otros miembros de la misma especie de SAMRS. Por ejemplo, T* podría unirse a A pero no a A*, y A* podría unirse a T pero no a T*. Por lo tanto, mediante un diseño cuidadoso, [15] los cebadores construidos a partir de SAMRS podrían evitar las interacciones cebador-cebador y permitir la detección sensible de SNP, así como la PCR multiplex.
Si bien los métodos anteriores están diseñados para reducir la formación de PD, otro enfoque apunta a minimizar la señal generada por los PD en la PCR cuantitativa . Este enfoque es útil siempre que se formen pocos PD y su efecto inhibidor sobre la acumulación de producto sea menor.
PCR de cuatro pasos : se utiliza cuando se trabaja con colorantes no específicos, como SYBR Green I. Se basa en la diferente longitud y, por lo tanto, en la diferente temperatura de fusión de los PD y la secuencia objetivo. En este método, la señal se adquiere por debajo de la temperatura de fusión de la secuencia objetivo, pero por encima de la temperatura de fusión de los PD. [16]
Sondas específicas de secuencia : las sondas TaqMan y de baliza molecular generan señales solo en presencia de su secuencia objetivo (complementaria), y esta especificidad mejorada impide la adquisición de señales (pero no los posibles efectos inhibitorios sobre la acumulación de producto) de los PD.
"Software en línea para la predicción de dímeros de cebadores". OligoAnalyzer 3.1 . Integrated DNA Technologies .
"Diseño de cebadores. ¿Qué es el dímero de cebadores?". Vídeo de YouTube . 3 de noviembre de 2013. Archivado desde el original el 20 de diciembre de 2021.