Los miembros de la familia de las pirofosfatasas translocadoras de H + , Na + (M + -PPasa) (TC# 3.A.10) se encuentran en las membranas vacuolares ( tonoplastos ) de plantas superiores, algas y protozoos , y tanto en bacterias como en arqueas . Por lo tanto, son enzimas antiguas.
Hasta la fecha se han caracterizado dos tipos de difosfatasa inorgánica , muy diferentes tanto en términos de secuencia de aminoácidos como de estructura : pirofosfatasas solubles y transmembrana de bombeo de protones (sPPasas y H( + )-PPasas, respectivamente). Las sPPasas son proteínas ubicuas que hidrolizan el pirofosfato para liberar calor, mientras que las H + -PPasas, hasta ahora no identificadas en células animales y fúngicas , acoplan la energía de la hidrólisis de PPi al movimiento de protones a través de las membranas biológicas . [1] [2] El último tipo está representado por este grupo de proteínas . H + -PPasas Pirofosfatasas inorgánicas de tipo vacuolar (V-PPasa) o bombas de protones de membrana vacuolar energizadas por pirofosfato . [3] En las plantas, las vacuolas contienen dos enzimas para acidificar el interior de la vacuola, la V-ATPasa y la V-PPasa (V es por vacuolar). [2]
Hasta la fecha se han caracterizado dos subclases bioquímicas distintas de H + -PPasas: estimuladas por K + y no sensibles a K + . [1] [3]
Se han secuenciado miembros completos de la familia H + -PPasa de numerosas bacterias, arqueas y eucariotas. Se ha informado que estas enzimas de bombeo de H + , que probablemente son homodímeras, se dividen en dos subfamilias filogenéticas. [4] Una subfamilia contiene invariablemente una cisteína conservada (Cys 222 ) e incluye todas las H + -PPasas independientes de K + conocidas , mientras que la otra tiene otra cisteína conservada (Cys 573 ) pero carece de Cys 222 e incluye todas las H + -PPasas dependientes de K + conocidas . [4] [5] Todas las H + -PPasas requieren Mg2 + , y las de las vacuolas de plantas, los acidocalcisomas de los protozoos y las bacterias fermentativas requieren mM de K + . Las de las bacterias respiratorias y fotosintéticas, así como las de las arqueas, dependen menos de K + . Sin embargo, pueden existir excepciones. [4] No se sabe con certeza si el K + se transporta.
La arqueona Methanosarcina mazei Gö1 codifica en su genoma dos pirofosfatasas (PPasas) translocadoras de H + , Mvp1 y Mvp2. La Mvp1 se parece a las PPasas bacterianas, mientras que la Mvp2 se parece a las PPasas vegetales. [6] Se ha demostrado que la Mvp2 transloca 1 H + por cada pirofosfato hidrolizado.
Algunas PPasas de Anaerostipes caccae , Chlorobium limicola , Clostridium tetani y Desulfuromonas acetoxidans han sido identificadas como transportadores de Na + dependientes de K + . [7] El análisis filogenético condujo a la identificación de un clado monofilético que comprende PPasas transportadoras de Na + caracterizadas y predichas (Na + -PPasas) dentro de la subfamilia dependiente de K + . Las PPasas transportadoras de H + (H + -PPasas) son más heterogéneas y forman al menos tres clados independientes en ambas subfamilias. [7]
Las enzimas vegetales probablemente bombean un H + tras la hidrólisis del pirofosfato, generando así una fuerza motriz de protones , positiva y ácida en el lumen del tonoplasto. Establecen una pmf de magnitud similar a la generada por las ATPasas translocadoras de H + en la misma membrana vacuolar. Las proteínas bacterianas y arqueales pueden catalizar reacciones totalmente reversibles, pudiendo así sintetizar pirofosfato cuando la pmf es suficiente. La enzima de R. rubrum contribuye a la pmf cuando la intensidad de la luz es insuficiente para generar una pmf de magnitud suficiente para soportar una rápida síntesis de ATP. Ambos extremos C de las subunidades diméricas de la V-PPasa están en el mismo lado de la membrana y están cerca uno del otro. [8] El dominio transmembrana 6 de la pirofosfatasa vacuolar H + - parece mediar tanto en la orientación de las proteínas como en el transporte de protones. [9]
La reacción de transporte generalizada catalizada por H + -PPasas es:
pirofosfato (P 2 ) + H 2 O + H + (citoplasma) → fosfato inorgánico (2 P i ) + H + (medio externo o luz vacuolar).
Los miembros eucariotas de la familia H + -PPasa son proteínas grandes de alrededor de 770 residuos de aminoacilo (aas) con 15 o 16 supuestas helicoidales α transmembrana (TMS). Se predice que los extremos N están en el lumen vacuolar, mientras que se piensa que los extremos C están en el citoplasma. Estas proteínas exhiben una región que muestra una similitud de secuencia convincente con las regiones que rodean al glutamato sensible a DCCD en las regiones C-terminales de las subunidades c de las ATPasas de tipo F (TC #3.A.2). Se ha demostrado que la H + -pirofosfatasa de Streptomyces coelicolor tiene una topología de 17 TMS con el dominio de unión al sustrato expuesto al citoplasma. El extremo C es hidrófilo con un único TMS C-terminal. Se cree que la estructura básica tiene 16 TMS con varios bucles citoplasmáticos grandes que contienen motivos funcionales. [10] Se ha demostrado que varios residuos ácidos de la H + -PPasa de Arabidopsis son importantes para su funcionamiento. Algunas plantas poseen isoformas de la H + -PPasa estrechamente relacionadas. Estas enzimas tienen el número de comisión enzimática EC 3.6.1.1 .
Lin et al. (2012) informaron la estructura cristalina de una H + -PPasa de Vigna radiata (VrH + -PPasa) en complejo con un análogo de sustrato no hidrolizable, imidodifosfato (IDP), a una resolución de 2,35 Å. Cada subunidad de VrH + -PPasa consiste en un dominio de membrana integral formado por 16 hélices transmembrana. [11] El IDP está unido en la región citosólica de cada subunidad y atrapado por numerosos residuos cargados y cinco iones Mg2 + . Una vía de translocación de protones no descrita previamente está formada por seis hélices transmembrana centrales. El bombeo de protones puede ser inicializado por hidrólisis de PP(i), y luego el H + es transportado al lumen vacuolar a través de una vía que consiste en Arg 242, Asp 294, Lys 742 y Glu 301. Lin et al. (2012) propusieron un modelo funcional del mecanismo de acoplamiento entre el bombeo de protones y la hidrólisis de PP(i) por las H + -PPasas. Las pirofosfatasas integrales de membrana (M-PPasas) son cruciales para la supervivencia de plantas, bacterias y parásitos protozoarios. Acoplan la hidrólisis o síntesis de pirofosfato al bombeo de Na + o H + . [11] La estructura de 2,6Å de la H + -PPasa de Thermotoga maritima en estado de reposo reveló una solución previamente desconocida para el bombeo de iones. [12] El centro hidrolítico, 20 angstroms por encima de la membrana, está acoplado a la compuerta formada por las conservadas Asp(243), Glu(246) y Lys(707) mediante un "embudo de acoplamiento" inusual de seis hélices α. La hélice 12 se desliza hacia abajo tras la unión del sustrato para abrir la compuerta mediante un mecanismo simple de cambio de unión. Debajo de la compuerta, cuatro hélices forman el canal de salida. La superposición de las hélices 3 a 6, 9 a 12 y 13 a 16 sugiere que las M-PPasas surgieron a través de la triplicación de genes. [12] Al comparar los sitios activos, los datos de inhibición de fluoruro y los diversos modelos para el transporte de iones, Kajander et al. concluyeron que las PPasas integrales de membrana probablemente utilizan la unión de pirofosfato para impulsar el bombeo. [13]
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