Una prueba genética o prueba de mutagénesis es una técnica experimental utilizada para identificar y seleccionar individuos que poseen un fenotipo de interés en una población mutagenizada. [1] Por lo tanto, una prueba genética es un tipo de prueba fenotípica . Las pruebas genéticas pueden proporcionar información importante sobre la función de los genes , así como sobre los eventos moleculares que subyacen a un proceso o vía biológica. Si bien los proyectos genómicos han identificado un extenso inventario de genes en muchos organismos diferentes, los análisis genéticos pueden proporcionar información valiosa sobre cómo funcionan esos genes. [2] [3] [4] [5] [6]
La genética directa (o un análisis genético directo) comienza con un fenotipo y luego intenta identificar la mutación causante y, por tanto, los genes responsables del fenotipo. Por ejemplo, la famosa pantalla de Christiane Nüsslein-Volhard y Eric Wieschaus mutagenizó moscas de la fruta y luego se propuso encontrar los genes que causaban los fenotipos mutantes observados. [7]
Las evaluaciones genéticas directas exitosas a menudo requieren un fondo genético definido y un procedimiento experimental simple. Es decir, cuando se mutagenizan varios individuos, deben ser genéticamente idénticos para que su fenotipo de tipo salvaje también sea idéntico y los fenotipos mutantes sean más fáciles de identificar. Un método de detección simple permite examinar a un mayor número de individuos, aumentando así la probabilidad de generar e identificar mutantes de interés. [3]
Dado que las mutaciones alélicas naturales son raras antes de la detección, los genetistas a menudo mutagenizan una población de individuos exponiéndolos a un mutágeno conocido , como una sustancia química o radiación, generando así una frecuencia mucho mayor de mutaciones cromosómicas . [1] En algunos organismos, los mutágenos se utilizan para realizar análisis de saturación , es decir, un análisis utilizado para descubrir todos los genes implicados en un fenotipo particular. Christiane Nüsslein-Volhard y Eric Wieschaus fueron los primeros en realizar este tipo de procedimiento de detección en animales. [8]
La genética inversa (o una pantalla genética inversa) comienza con un gen conocido y analiza el efecto de su alteración mediante el análisis de los fenotipos resultantes. Por ejemplo, en un cribado knock-out, uno o más genes se eliminan por completo y los mutantes con eliminación se analizan en busca de fenotipos. Se han realizado exámenes de este tipo para todos los genes de muchas bacterias e incluso de organismos complejos, como C. elegans . [1] Una evaluación genética inversa generalmente comienza con una secuencia genética seguida de una inactivación dirigida. [9] Además, induce mutaciones en organismos modelo para aprender su papel en la enfermedad. [10] La genética inversa también se utiliza para proporcionar estadísticas extremadamente precisas sobre mutaciones que ocurren en genes específicos. A partir de estas pantallas, usted puede determinar qué tan fortuitas son las mutaciones y con qué frecuencia ocurren. [11]
Se han ideado muchas variaciones de detección para dilucidar un gen que conduce a un fenotipo mutante de interés.
Una evaluación potenciadora comienza con un individuo mutante que tiene un proceso de interés afectado con una mutación genética conocida. Luego, la pantalla se puede utilizar para identificar genes adicionales o mutaciones genéticas que desempeñan un papel en ese proceso biológico o fisiológico. Una prueba de potenciador genético identifica mutaciones que mejoran un fenotipo de interés en un individuo ya mutante. El fenotipo del doble mutante (individuo con la mutación de fondo original y potenciadora) es más prominente que cualquiera de los fenotipos del mutante único. La mejora debe superar los fenotipos esperados de las dos mutaciones por sí solas y, por lo tanto, cada mutación puede considerarse un potenciador de la otra. El aislamiento de mutantes potenciadores puede conducir a la identificación de genes que interactúan o que actúan de forma redundante entre sí. [12]
Se utiliza un cribado de supresores para identificar mutaciones supresoras que alivian o revierten el fenotipo de la mutación original, en un proceso definido como viabilidad sintética . [13] Las mutaciones supresoras pueden describirse como segundas mutaciones en un sitio del cromosoma distinto de la mutación en estudio, que suprimen el fenotipo de la mutación original. [14] Si la mutación está en el mismo gen que la mutación original, se conoce como supresión intragénica , mientras que una mutación ubicada en un gen diferente se conoce como supresión extragénica o supresión intergénica . [1] Las mutaciones supresoras son extremadamente útiles para definir las funciones de las vías bioquímicas dentro de una célula y las relaciones entre diferentes vías bioquímicas.
Una pantalla sensible a la temperatura implica realizar cambios de temperatura para mejorar un fenotipo mutante. Una población cultivada a bajas temperaturas tendría un fenotipo normal; sin embargo, la mutación en el gen en particular lo haría inestable a una temperatura más alta. Una pantalla para detectar la sensibilidad a la temperatura en las moscas de la fruta, por ejemplo, podría implicar aumentar la temperatura en la jaula hasta que algunas moscas se desmayen y luego abrir un portal para dejar escapar a las demás. Los individuos seleccionados en un cribado pueden portar una versión inusual de un gen implicado en el fenotipo de interés. Una ventaja de los alelos encontrados en este tipo de análisis es que el fenotipo mutante es condicional y puede activarse simplemente elevando la temperatura. Una mutación nula en dicho gen puede ser letal para el embrión y dichos mutantes no se detectarían en una prueba básica. Lee Hartwell y Paul Nurse llevaron a cabo de forma independiente un famoso análisis sensible a la temperatura para identificar mutantes defectuosos en el ciclo celular en S. cerevisiae y S. pombe , respectivamente.
La detección de interferencia de ARN (ARNi) es esencialmente una detección de genética directa que utiliza una técnica de genética inversa. De manera similar a las pruebas genéticas clásicas del pasado, el éxito de los estudios de ARNi a gran escala depende de un desarrollo cuidadoso de los ensayos fenotípicos y su interpretación. [9] En Drosophila , el ARNi se ha aplicado en células cultivadas o in vivo para investigar funciones genéticas y efectuar la función de genes individuales a escala de todo el genoma. El ARNi se utiliza para silenciar la expresión genética en Drosophila inyectando ARNbc en embriones tempranos e interfiriendo con los genes Frizzled y Frizzled2 creando defectos en el patrón embrionario que imitan la pérdida de la función sin alas. [15]
CRISPR/Cas se utiliza principalmente para exámenes genéticos inversos. CRISPR tiene la capacidad de crear bibliotecas de miles de mutaciones genéticas precisas y puede identificar nuevos tumores, así como validar tumores más antiguos en la investigación del cáncer. La biblioteca CRISPR-Cas9 knockout (GeCKO) a escala genómica dirigida a 18.080 genes con 64.751 secuencias guía únicas identifica genes esenciales para la viabilidad celular en el cáncer. Sistema bacteriano CRISPR-Cas9 para diseñar mutaciones de pérdida de función (LOF) y ganancia de función (GOF) en organoides intestinales humanos no transformados con el fin de demostrar un modelo de cáncer colorrectal (CCR) . También se puede utilizar para estudiar las consecuencias funcionales de las mutaciones in vivo al permitir la edición directa del genoma en células somáticas. [10]
Según el enfoque de la genética clásica , un investigador localizaría (mapearía) el gen en su cromosoma mediante el cruzamiento con individuos que portan otros rasgos inusuales y recopilaría estadísticas sobre la frecuencia con la que los dos rasgos se heredan juntos. Los genetistas clásicos habrían utilizado rasgos fenotípicos para mapear los nuevos alelos mutantes . Con la llegada de secuencias genómicas para sistemas modelo como Drosophila melanogaster , Arabidopsis thaliana y C. elegans , ahora se han identificado muchos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que pueden usarse como rasgos para el mapeo. De hecho, la pantalla de Heidelberg , que permitió realizar pruebas masivas de mutantes y fue desarrollada en 1980 por Nüsslein-Volhard y Wieschaus , allanó el camino para los futuros científicos en este campo. [4] Los SNP son los rasgos preferidos para el mapeo ya que son muy frecuentes, del orden de una diferencia por 1000 pares de bases, entre diferentes variedades de organismos. También se pueden utilizar mutágenos como inserciones aleatorias de ADN mediante transformación o transposones activos para generar nuevos mutantes. Estas técnicas tienen la ventaja de etiquetar los nuevos alelos con un marcador molecular (ADN) conocido que puede facilitar la rápida identificación del gen. [8]
La clonación posicional es un método de identificación de genes en el que un gen para un fenotipo específico se identifica sólo por su ubicación cromosómica aproximada (pero no por su función); esto se conoce como la región candidata . Inicialmente, la región candidata se puede definir usando técnicas como el análisis de ligamiento y luego se usa la clonación posicional para estrechar la región candidata hasta que se encuentren el gen y sus mutaciones. La clonación posicional normalmente implica el aislamiento de segmentos de ADN parcialmente superpuestos de bibliotecas genómicas para avanzar a lo largo del cromosoma hacia un gen específico. Durante el curso de la clonación posicional, es necesario determinar si el segmento de ADN actualmente en consideración es parte del gen.
Las pruebas utilizadas para este propósito incluyen hibridación entre especies, identificación de islas CpG no metiladas , captura de exones , selección directa de ADNc , análisis por computadora de la secuencia de ADN, detección de mutaciones en individuos afectados y pruebas de expresión genética. Para los genomas en los que se conocen las regiones de polimorfismos genéticos , la clonación posicional implica identificar polimorfismos que flanquean la mutación. Este proceso requiere que fragmentos de ADN del marcador genético conocido más cercano sean clonados y secuenciados progresivamente, acercándose al alelo mutante con cada nuevo clon. Este proceso produce un mapa contig del locus y se conoce como paseo cromosómico . Con la finalización de proyectos de secuenciación del genoma como el Proyecto Genoma Humano , la clonación posicional moderna puede utilizar contigs ya preparados de las bases de datos de secuencias del genoma directamente.
Para cada nuevo clon de ADN se identifica un polimorfismo y se prueba en la población mapeada para determinar su frecuencia de recombinación en comparación con el fenotipo mutante. Cuando el clon de ADN está en el alelo mutante o cerca de él, la frecuencia de recombinación debe ser cercana a cero. Si el recorrido cromosómico continúa a través del alelo mutante, los nuevos polimorfismos comenzarán a mostrar un aumento en la frecuencia de recombinación en comparación con el fenotipo mutante. Dependiendo del tamaño de la población mapeada, el alelo mutante se puede reducir a una región pequeña (<30 Kb). Luego se requiere una comparación de secuencias entre el ADN de tipo salvaje y el mutante en esa región para localizar la mutación del ADN que causa la diferencia fenotípica.
La clonación posicional moderna puede extraer más directamente información de proyectos de secuenciación genómica y datos existentes mediante el análisis de los genes en la región candidata. Luego se pueden priorizar los genes de enfermedades potenciales de la región candidata, lo que podría reducir la cantidad de trabajo involucrado. Los genes con patrones de expresión consistentes con el fenotipo de la enfermedad, que muestran una función (supuesta) relacionada con el fenotipo u homólogos a otro gen vinculado al fenotipo son todos candidatos prioritarios. La generalización de las técnicas de clonación posicional de esta manera también se conoce como descubrimiento de genes posicionales.
La clonación posicional es un método eficaz para aislar genes de enfermedades de manera imparcial y se ha utilizado para identificar genes de enfermedades de la distrofia muscular de Duchenne , la enfermedad de Huntington y la fibrosis quística . Sin embargo, surgen complicaciones en el análisis si la enfermedad presenta heterogeneidad de locus.