La mutagénesis en casete es un tipo de mutagénesis dirigida que utiliza una secuencia de oligonucleótidos corta de doble cadena ( casete genético ) para reemplazar un fragmento de ADN diana . Utiliza extremos de digestión de enzimas de restricción complementarios en el ADN diana y el casete genético para lograr especificidad. Es diferente de los métodos que utilizan un solo oligonucleótido en que un solo casete genético puede contener múltiples mutaciones. A diferencia de muchos métodos de mutagénesis dirigida, la mutagénesis en casete tampoco implica la extensión del cebador por la ADN polimerasa . [1] [2] [3] [4] [5]
En primer lugar, se utilizan enzimas de restricción para cortar cerca de la secuencia objetivo en el ADN contenido en un vector adecuado . Este paso elimina la secuencia objetivo y todo lo que se encuentre entre los sitios de restricción. Luego, el ADN bicatenario sintético que contiene la mutación deseada y los extremos que son complementarios a los extremos de la digestión de restricción se ligan en lugar de la secuencia eliminada. Finalmente, el constructo resultante se secuencia para verificar que la secuencia objetivo contiene la mutación deseada. [1]
El uso de casetes genéticos sintéticos permite un control total sobre el tipo de mutación que se puede generar. Al estudiar las funciones de las proteínas, la mutagénesis por casete puede permitir a un científico cambiar aminoácidos individuales introduciendo codones diferentes u omitiendo codones. [1] [2]
Al incluir la secuencia SD y los primeros codones de un gen, un científico puede afectar fácil y dramáticamente el nivel de expresión de una proteína alterando estas secuencias reguladoras . [2]
Para utilizar este método, se debe conocer la secuencia de la secuencia diana y los sitios de restricción cercanos. Dado que se utilizan enzimas de restricción , para que este método sea útil, los sitios de restricción que flanquean el ADN diana deben ser únicos en el sistema gen / vector para que el casete genético pueda insertarse con especificidad. La longitud de la secuencia flanqueada por los sitios de restricción también es un factor limitante debido al uso de casetes genéticos sintéticos. [2] [3]
Dado que un casete de genes puede contener múltiples mutaciones, se necesita menos síntesis y purificación de oligonucleótidos totales. En comparación con los métodos de mutagénesis que requieren la síntesis de ADN bicatenario utilizando una plantilla monocatenaria (1-30% in vitro en M13 ), la eficiencia de la ligadura del casete de oligodesoxinucleótidos es cercana al 100%. La alta eficiencia de la mutagénesis significa que los mutantes pueden examinarse directamente mediante secuenciación. [2] Una vez que el vector está configurado con sitios de restricción flanqueantes, todas las manipulaciones (es decir, mutagénesis , secuenciación , expresión ) se pueden realizar en el mismo plásmido . [2]