Los modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer son modelos celulares o de organismos que se utilizan en la investigación para investigar cuestiones biológicas sobre la enfermedad de Alzheimer , así como para desarrollar y probar nuevos tratamientos terapéuticos. La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo progresivo asociado al envejecimiento, que se produce tanto de forma esporádica (la forma más común de diagnóstico) como debido a mutaciones transmitidas de forma familiar en genes asociados con la patología del Alzheimer. [1] [2] Los síntomas comunes asociados con la enfermedad de Alzheimer incluyen: pérdida de memoria , confusión y cambios de humor. [3]
Dado que la enfermedad de Alzheimer afecta a alrededor de 55 millones de pacientes en todo el mundo y representa aproximadamente entre el 60 y el 70 % de todos los casos de demencia, cada año se gastan miles de millones de dólares en investigaciones para comprender mejor los mecanismos biológicos de la enfermedad y desarrollar tratamientos terapéuticos eficaces para ella. [2] [4] Los investigadores suelen utilizar tejido humano post-mortem o modelos experimentales para realizar experimentos relacionados con la enfermedad de Alzheimer. [5] Los modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer son particularmente útiles ya que permiten una manipulación compleja de sistemas biológicos para dilucidar preguntas sobre la enfermedad de Alzheimer sin el riesgo de dañar a los humanos. Estos modelos a menudo tienen modificaciones genéticas que les permiten ser más representativos de la enfermedad de Alzheimer humana y su patología asociada: placas extracelulares de beta amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares intracelulares (NFT). [6] Los métodos actuales utilizados por los investigadores son: cultivo celular tradicional en 2D , cultivo celular en 3D , sistemas microfisiológicos y modelos animales .
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El cultivo celular bidimensional tradicional es un modelo experimental útil de la enfermedad de Alzheimer para realizar experimentos de manera de alto rendimiento. Estos cultivos se producen en un plato o matraz en una monocapa y pueden estar formados por un solo tipo de célula o varios tipos de células. [7] Los cultivos 2D a menudo tienen dificultades para producir placas de β-amiloide insolubles incluso cuando son capaces de secretar el péptido β-amiloide. [8] [9] Los tipos comunes de cultivos celulares 2D utilizados para modelar la enfermedad de Alzheimer son líneas celulares inmortalizadas , cultivos de neuronas primarias y células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de pacientes.
Las líneas celulares inmortalizadas son células de un organismo que han sido manipuladas genéticamente para poder proliferar in vitro, lo que las convierte en una herramienta útil para los investigadores, ya que pueden hacerlo rápidamente, lo que permite una experimentación de alto rendimiento. Estas mutaciones pueden ocurrir por una mutación causada naturalmente, como las que se encuentran en las células cancerosas, o por ser introducidas por investigadores. Las líneas celulares inmortalizadas comunes utilizadas para estudiar la enfermedad de Alzheimer incluyen: riñón embrionario humano 293 (HEK293), neuroblastoma humano (SH-SY5Y), neuroglioma humano (H4), mesencefálico embrionario humano (LUHMES), progenitor neural humano (ReN) y feocromocitoma ( PC12) células. [10] Estos tipos de células están disponibles comercialmente, son relativamente económicas y fáciles de cultivar y mantener. [10] [11] Los compuestos pro-muerte se pueden utilizar en estos modelos para inducir la muerte celular relacionada con la enfermedad de Alzheimer. Estos compuestos incluyen: amiloide-β 42, proteína tau, ácido glutámico [12] y compuestos oxidativos/proinflamatorios. [13]
Los cultivos de neuronas primarias se generan a partir de tejido cerebral de roedores embrionarios o posnatales y se cultivan en placas. [14] Las regiones cerebrales comunes utilizadas en cultivos para estudiar la enfermedad de Alzheimer incluyen el hipocampo , la corteza y la amígdala ; sin embargo cualquier región del cerebro es apta para cultivos. [7] Este método requiere la disección de la región cerebral deseada del tejido de roedor seguida de pasos de digestión, disociación y siembra en placas. [14] Como estos cultivos se derivan directamente del tejido cerebral de roedores, morfológica y fisiológicamente se parecen a las células cerebrales humanas, contienen múltiples tipos de células neuronales y no proliferan. [10] Cuando se cultivan inicialmente, estas células son esféricas y con el tiempo comienzan a formar axones , dendritas y, finalmente, a desarrollar conexiones sinápticas . [14]
Las líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de pacientes son únicas en las que se toman células somáticas diferenciadas de pacientes con enfermedad de Alzheimer y se revierten en células madre pluripotentes mediante un cóctel de factor transcripcional ectópico "Tamanaka". [11] Estas células madre pueden luego dirigirse para diferenciarse en muchos tipos de células, incluidas neuronas, astrocitos , microglía , oligodendrocitos , pericitos y células endoteliales . [5] [11] Esto permite que estos modelos se generen tanto a partir de pacientes con enfermedad de Alzheimer familiar (FAD) de inicio temprano con mutaciones en los genes APP , PSEN1 o PSEN2 como de pacientes con enfermedad de Alzheimer (SAD) de inicio tardío/esporádico. una población que no se replica completamente en modelos animales. Dado que el SAD es la forma de EA más comúnmente diagnosticada, esto destaca a las iPSC como herramientas clave para comprender esta forma de la enfermedad. [5] Estas células también se pueden comprar comercialmente. [15] [16] La tecnología CRISPR-Cas9 se puede utilizar junto con las células iPSC para generar neuronas que portan múltiples mutaciones FAD. [5] [10] Una desventaja importante de estos modelos es que no pueden parecerse adecuadamente a las neuronas maduras, además de ser más costosos y difíciles de mantener. [11] También se ha demostrado que las iPSC exhiben inestabilidad genómica y desarrollan mutaciones adicionales cuando se pasan (se cosechan y se vuelven a sembrar en cultivos hijos) numerosas veces, lo que plantea tanto problemas de seguridad para el uso en pacientes como posibles problemas de reproducibilidad en estudios experimentales. [5] Debido a la naturaleza de los procedimientos de reprogramación, las células iPSC pierden firmas celulares y epigenéticas adquiridas por el envejecimiento y los factores ambientales, lo que limita la capacidad de las iPSC para recapitular enfermedades asociadas con el envejecimiento, como la enfermedad de Alzheimer. Si bien estos cultivos tienen algunas limitaciones, muchos descubrimientos fundamentales sobre la biología de la enfermedad de Alzheimer se han dilucidado utilizando este sistema modelo. [ cita necesaria ]
Los métodos de cultivo de organoides tridimensionales se han convertido en una forma popular de recapitular la patología de la EA en un entorno más "similar al cerebro" que el cultivo 2D tradicional, ya que crean una estructura organizada similar a la de la corteza humana. [10] [24] Esto ha demostrado ser eficaz específicamente para modelar la enfermedad de Alzheimer, ya que los cultivos 2D tienden a no producir amiloide-β insoluble, mientras que los modelos de cultivo 3D sí pueden. [8] Estos modelos consisten en múltiples tipos de células neuronales cocultivadas juntas en matrices artificiales que permiten comprender cómo las células no neuronales y la neuroinflamación influyen en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. [11] Los tipos de células neuronales expresados en estos modelos a menudo incluyen neuronas , astrocitos , microglía , oligodendrocitos , células epiteliales y endoteliales . [9] [11] Estos organoides se desarrollan durante muchos meses para mostrar la patología de Alzheimer y pueden mantenerse durante largos períodos de tiempo. [5] [9] Pueden derivarse tanto de iPSC como de células inmortalizadas indiferenciadas y normalmente alcanzan un diámetro de varios milímetros. [9] [24] A los cultivos 3D se les puede permitir que se autoorganicen o colocarlos bajo una formación guiada en la que los factores exógenos influyan en el patrón de diferenciación del organoide. [9] Los métodos de cultivo 3D han mostrado una agregación de β-amiloide, una acumulación de tau fosforilada y anomalías endosómicas más sólidas que los métodos de cultivo 2D de las mismas líneas celulares, lo que indica una patología acelerada. [5] [24]
Los problemas comunes que surgen del uso de cultivos 3D son la falta de vasculatura dentro del organoide, lo que provoca muerte celular y disfunción en las capas internas. [5] [9] Actual [ ¿cuándo? ] Los esfuerzos se centran en introducir células endoteliales en cultivos de formación guiada para crear sistemas vasculares y proporcionar distribución de nutrientes a las capas profundas. [5] [9] Los organoides autoorganizados también varían en términos de proporción y ubicación de las células expresadas, lo que genera desafíos en la reproducibilidad de los experimentos. [9] Se han puesto más esfuerzos en los organoides de formación guiada para dar cuenta de este problema; sin embargo, este método requiere más tiempo y es difícil de optimizar. [9] La capacidad del cultivo de organoides 3D para parecerse a los fenotipos envejecidos también es limitada, ya que muchos métodos de organoides se basan en iPSC que son más similares a las células cerebrales prenatales debido a protocolos de reprogramación. [9] Los investigadores actualmente [ ¿cuándo? ] investiga perfiles transcripcionales comunes asociados con la enfermedad de Alzheimer y el envejecimiento para reintroducir estos paisajes en las iPSC para futuras investigaciones biomédicas y desarrollo terapéutico. [ cita necesaria ]
Los sistemas microfisiológicos neuronales, también conocidos como " cerebro en un chip ", son una combinación de cultivos 3D y una plataforma de microfluidos , que hace circular los medios proporcionados a las células cultivadas. [10] Estos dispositivos son beneficiosos ya que mejoran la viabilidad celular y modelan mejor las condiciones fisiológicas, ya que mejoran la disponibilidad de oxígeno y el suministro de nutrientes a las capas internas de cultivos 3D. [9] [25] Estos sistemas además introducen señales fisiológicas como estrés, tensión y compresión de fluidos, lo que permite que estas condiciones in vitro se parezcan mejor al entorno in vivo. [8] Se demostró que los sistemas microfisiológicos replican la agregación de amiloide-β, la tau hiperfosforilada y la neuroinflamación, además de mostrar reclutamiento microglial, liberación de citocinas y quimiocinas y activación neurotóxica microglial como respuesta a interacciones célula-célula más fisiológicamente relevantes. [10] Estos sistemas también se pueden desarrollar incorporando células endoteliales cerebrales para imitar la barrera hematoencefálica , lo que lo convierte en un modelo extremadamente útil para la disfunción de la BHE en la enfermedad de Alzheimer, la detección de nuevas terapias potenciales para pasar de la sangre al cerebro y la farmacocinética terapéutica . así como las tendencias de adsorción, distribución, metabolismo, eliminación y toxicidad de fármacos (ADMET). [8] [10] [25]
Los modelos animales de roedores de la enfermedad de Alzheimer se utilizan comúnmente en la investigación, ya que los roedores y los humanos tienen muchas de las mismas regiones cerebrales y sistemas de neurotransmisores importantes . [5] Estos modelos son pequeños, fáciles de albergar y se reproducen muy bien. [26] Los ratones y las ratas, en promedio, tienden a vivir 2 años, una esperanza de vida mucho más corta que la de los humanos, lo que presenta limitaciones y beneficios para completar el experimento más rápidamente. [5]
Para recapitular y acelerar la patología de la enfermedad de Alzheimer humana, los científicos suelen introducir mutaciones asociadas a FAD . [27] Los genes comunes destinados a la ingeniería genética en modelos animales son APP , MAPT , PSEN1 , PSEN2 y APOE . [6] Esto da como resultado que los modelos animales tengan una mayor tendencia a formar placas de β-amiloide y/o ovillos neurofibrilares, las dos características patológicas distintivas de la enfermedad de Alzheimer. [6] Estos genes mutados pueden sobreexpresarse (modelos de primera generación) o expresarse a niveles endógenos (modelos de segunda generación) como una forma de replicar aún más la patología de la enfermedad. [6] Los científicos también sobreexpresan genes humanos no mutados con la esperanza de ver una patología similar a la enfermedad de Alzheimer. [28] Estas mutaciones introducidas o la sobreexpresión de genes asociados al Alzheimer humano pueden llevar a que estos animales muestren además deterioro cognitivo, déficits en la potenciación a largo plazo (LTP), pérdida sináptica, gliosis y pérdida neuronal. Como los modelos actuales dependen en gran medida de las mutaciones FAD para inducir una patología similar a la del Alzheimer, todavía no existe un modelo ideal que replique completamente la SAD (enfermedad de Alzheimer esporádica), que es el tipo de diagnóstico más común en los pacientes. [29]
Los métodos comunes utilizados para generar estas líneas son el uso de transgenes controlados por un promotor específico, la recombinación Cre-Lox y el sistema CRISPR-Cas9 . Los científicos también pueden utilizar métodos de inyección como la inyección intracerebroventricular, [30] la inyección intravenosa, [31] [32] o la inyección intrahipocampal [33] para modificar roedores de tipo salvaje para que muestren la patología de la enfermedad de Alzheimer. Estos modelos de roedores se utilizan a menudo para probar y desarrollar medicamentos que tratan la enfermedad de Alzheimer antes de pasar a ensayos clínicos en humanos. [ cita necesaria ]
Los investigadores pueden utilizar primates no humanos para estudiar los mecanismos de la enfermedad de Alzheimer y desarrollar terapias. Los primates no humanos son útiles porque tienen un patrón de envejecimiento más similar al de los humanos en comparación con los modelos de roedores. [60] Durante el envejecimiento de los primates no humanos, pueden mostrar neuropatía, cambios cognitivos y depósitos de β-amiloide, similares a los de la enfermedad de Alzheimer. [60] Si bien estos modelos son útiles para estudiar el proceso de envejecimiento, no siempre son modelos exactos de la enfermedad de Alzheimer. Los primates no humanos comunes utilizados en la investigación de la EA incluyen: monos rhesus ( Macaca mulattas ), macacos de cola muñón ( Macaca arctoides ), lémures ratón ( Microcebus murinus ), tití común ( Callithrix jacchus ) y macacos cangrejeros ( Macaca fascicularis ). [60] Estos modelos se pueden estudiar tanto de forma espontánea como mediante la inducción artificial de respuestas a la enfermedad de Alzheimer. [60] Las técnicas comunes utilizadas para inducir estos modelos incluyen: lesión del sistema nervioso colinérgico, inyección de β-amiloide, formaldehído intrínseco y estreptozotocina (un compuesto de azúcar de metil nitrosourea que induce diabetes) . [60]