Una técnica especializada para la difracción de electrones.
La difracción de electrones en microcristales , o MicroED , [1] [2] es un método CryoEM que fue desarrollado por el laboratorio Gonen a finales de 2013 en el Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes . MicroED es una forma de cristalografía electrónica en la que se utilizan cristales tridimensionales delgados para la determinación de la estructura mediante difracción de electrones . Antes de esta demostración, la cristalografía electrónica macromolecular (proteína) se utilizaba principalmente en cristales 2D, por ejemplo. [3] [4] El método es una de varias versiones modernas de enfoques para determinar estructuras atómicas mediante difracción de electrones, demostrado por primera vez para las posiciones de los átomos de hidrógeno en cristales de NH4Cl por WE Laschkarew e ID Usykin en 1933, [5] que desde entonces ha sido utilizado para superficies, [6] mediante difracción de electrones de precesión , [7] y gran parte de los primeros trabajos se describen en el trabajo de Boris Vainshtein [8] y Douglas L. Dorset . [9]
El método se desarrolló para determinar la estructura de proteínas a partir de nanocristales que normalmente no son adecuados para la difracción de rayos X debido a su tamaño. [10] Los cristales que tienen una milmillonésima parte del tamaño necesario para la cristalografía de rayos X pueden producir datos de alta calidad. [11] Las muestras se congelan hidratadas como para todas las demás modalidades de CryoEM, pero en lugar de usar el microscopio electrónico de transmisión ( TEM ) en modo de imagen, se usa en modo de difracción con una baja exposición de electrones (típicamente < 0,01 e − /Å 2 /s ). El nanocristal se expone al haz difractor y se gira continuamente [2] mientras la difracción se recoge en una cámara rápida como una película. [2] Los datos MicroED luego se procesan utilizando software para cristalografía de rayos X para el análisis y refinamiento de la estructura. [12] El hardware y el software utilizados en un experimento MicroED son estándar y están ampliamente disponibles. [13] [14]
Desarrollo
La difracción de electrones para resolver estructuras cristalinas se remonta a los primeros días de la difracción de electrones. La primera demostración exitosa de MicroED fue realizada en 2013 por el laboratorio Gonen [1] para la estructura de la lisozima , una proteína de prueba clásica en cristalografía de rayos X.
Configuración experimental
Se han publicado protocolos detallados para configurar el microscopio electrónico y para la recopilación de datos. [15]
Instrumentación
Microscopio
Los datos de MicroED se recopilan mediante microscopía electrónica de transmisión (criogénica) . El microscopio puede equiparse con una apertura de área seleccionada, pero MicroED también se puede realizar sin una apertura de área seleccionada. Si bien se ha informado que algunas estructuras no se congelan, el daño por radiación a veces se minimiza y se obtiene una resolución más alta mediante el uso de enfriamiento criogénico incluso para moléculas pequeñas. [dieciséis]
Detectores
Se han utilizado diversos detectores para recopilar datos de difracción de electrones en experimentos MicroED. Se han utilizado detectores que utilizan dispositivos de carga acoplada (CCD) y tecnología complementaria de semiconductores de óxido metálico (CMOS) . Con los detectores CMOS, se pueden interpretar recuentos de electrones individuales. [17] Más recientemente, los detectores de electrones directos se han utilizado con éxito tanto en modo lineal como en modo de conteo. [18] [19] En estos ejemplos, el recuento de electrones permitió la fase ab initio y la visualización de hidrógenos en proteínas.
Recopilación de datos
Todavía difracción
La publicación inicial de prueba de concepto sobre MicroED utilizó cristales de lisozima. [1] Se recopilaron hasta 90 grados de datos de un solo nanocristal, con pasos discretos de 1 grado entre fotogramas. Cada patrón de difracción se recolectó con una tasa de dosis ultrabaja de ~0,01 e − /Å 2 /s. Los datos de 3 cristales se fusionaron [20] para producir una estructura de resolución de 2,9 Å con buenas estadísticas de refinamiento, lo que permitió la determinación de la estructura de una proteína dosis-sensible a partir de microcristales 3D en condiciones criogénicas.
Rotación continua
MicroED utiliza rotación continua durante el esquema de recopilación de datos. [2] Aquí el cristal gira lentamente en una sola dirección mientras la difracción se graba en una cámara rápida como una película. Esto condujo a varias mejoras en la calidad de los datos y permitió su procesamiento utilizando software cristalográfico de rayos X estándar. [2] MicroED de rotación continua mejora el muestreo del espacio recíproco. [21]
Procesamiento de datos
Se han publicado protocolos detallados para el procesamiento de datos MicroED. [12] Cuando los datos MicroED se recopilan mediante rotación continua de la etapa, se puede utilizar el software de cristalografía estándar [14] .
Diferencias entre MicroED y otros métodos de difracción de electrones
Otros métodos de difracción de electrones que se han desarrollado y demostrado que funcionan incluyen la tomografía de difracción automatizada (ADT) [22] y la difracción de electrones por rotación (RED [23] ). Estos métodos difieren ligeramente de MicroED: en ADT se utilizan pasos discretos de inclinación del goniómetro para cubrir el espacio recíproco en combinación con la precesión del haz para reducir los efectos de difracción dinámica. [22] ADT utiliza hardware y software para microscopía electrónica de transmisión de barrido y precesión para el seguimiento de cristales. [22] RED se realiza en TEM pero el goniómetro se inclina en pasos discretos y la inclinación del haz se utiliza para llenar los espacios. [23] Se utiliza software para procesar datos ADT y RED. [23]
Hitos
Alcance del método
MicroED se ha utilizado para determinar las estructuras de proteínas globulares grandes, [24] proteínas pequeñas, [2] péptidos, [25] proteínas de membrana, [26] moléculas orgánicas, [27] [28] y compuestos inorgánicos. [29] En muchos de estos ejemplos se observaron hidrógenos e iones cargados. [25] [26]
Nuevas estructuras de α-sinucleína de la enfermedad de Parkinson
Las primeras estructuras resueltas por MicroED se publicaron a finales de 2015. [25] Estas estructuras eran de fragmentos de péptidos que forman el núcleo tóxico de la α-sinculeína , la proteína responsable de la enfermedad de Parkinson y permiten comprender el mecanismo de agregación de los agregados tóxicos. Las estructuras se resolvieron con una resolución de 1,4 Å.
Nueva estructura proteica de R2lox
La primera estructura novedosa de una proteína resuelta por MicroED se publicó en 2019. [30] La proteína es la oxidasa de unión a ligando similar a la metaloenzima R2 (R2lox) de Sulfolobus acidocaldarius. La estructura se resolvió con una resolución de 3,0 Å mediante reemplazo molecular utilizando un modelo de identidad de secuencia del 35% construido a partir del homólogo más cercano con una estructura conocida.
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Otras lecturas
- Antecedentes sobre MicroED de ThermoFisher Scientific, un importante productor de microscopios electrónicos de transmisión
- Video entrevista sobre el desarrollo de MicroED y sus aplicaciones
- Los antecedentes de Janelia Archives sobre MicroED
- Antecedentes y publicaciones sobre MicroED del Laboratorio Gonen