Los tipos efectores similares a activadores de transcripción ( TALE-likes ) son un grupo de proteínas de unión al ADN bacteriano que llevan el nombre del primer grupo y aún mejor estudiado, los TALE de la bacteria Xanthomonas . Los TALE son factores importantes en las enfermedades de las plantas causadas por la bacteria Xanthomonas , pero son conocidos principalmente por su papel en biotecnología como proteínas programables de unión al ADN, particularmente en el contexto de las nucleasas TALE . Además, se han encontrado similares a TALE en muchas cepas del complejo de especies bacterianas Ralstonia solanacearum, en la cepa HKI 454 de Paraburkholderia rhizoxinica y en dos bacterias marinas desconocidas. Aún no está claro si todas estas proteínas forman o no un único grupo filogenético.
La característica unificadora de los tipos TALE son sus conjuntos en tándem de repeticiones de unión al ADN. Estas repeticiones tienen, con pocas excepciones, entre 33 y 35 aminoácidos de longitud y están compuestas por dos hélices alfa a cada lado de un bucle flexible que contiene los residuos de unión de bases de ADN y con repeticiones vecinas unidas por bucles enlazadores flexibles. [1] La evidencia de esta estructura común proviene en parte de las estructuras cristalinas resueltas de TALE [2] y de un tipo TALE de Burkholderia (BAT), [3] pero también de la conservación del código que todos los tipos TALE utilizan para reconocer el ADN. -secuencias. De hecho, las repeticiones TALE, RipTAL y BAT se pueden mezclar y combinar para generar proteínas funcionales de unión al ADN con afinidad variable. [4]
Los TALE son el primer grupo identificado, mejor estudiado y más grande dentro de los TALE-likes. Los TALE se encuentran en todo el género bacteriano Xanthomonas , [5] y comprenden principalmente patógenos vegetales. Se ha demostrado que todos los TALE que se han estudiado se secretan como parte del sistema de secreción de tipo III en las células de la planta huésped. Una vez dentro de la célula huésped, se trasladan al núcleo, se unen a secuencias de ADN específicas dentro de los promotores del huésped y activan genes posteriores. Se cree que cada parte de este proceso se conserva en todos los TALE. La única diferencia significativa entre los TALE individuales, según los conocimientos actuales, es la secuencia de ADN específica a la que se une cada TALE. Los TALE de cepas incluso estrechamente relacionadas difieren en la composición de las repeticiones que conforman su dominio de unión al ADN. [6] La composición repetida determina la preferencia de unión al ADN. En particular, la posición 13 de cada repetición confiere la preferencia de base de ADN de cada repetición. Durante las primeras investigaciones se observó que casi todas las diferencias entre las repeticiones de una única matriz de repeticiones TALE se encuentran en las posiciones 12 y 13 y este hallazgo llevó a la hipótesis de que estos residuos determinan la preferencia de base. [7] De hecho, se dice comúnmente que las posiciones repetidas 12 y 13, denominadas conjuntamente Residuo variable repetido (RVD), confieren especificidad de base a pesar de la evidencia clara de que la posición 13 es el residuo determinante de la base. [8] Además del dominio repetido, los TALE también poseen una serie de características conservadas en los dominios que flanquean las repeticiones. Estos incluyen dominios para la secreción de tipo III, localización nuclear y activación transcripcional. Esto permite que los TALE lleven a cabo su función biológica como proteínas efectoras secretadas en las células de la planta huésped para activar la expresión de genes específicos del huésped.
Si bien las posiciones RVD suelen ser las únicas posiciones variables dentro de una única matriz de repetición de TALE, existen más diferencias al comparar matrices de repetición de diferentes TALE. La diversidad de TALE en todo el género Xanthomonas es considerable, pero un hallazgo particularmente sorprendente es que la historia evolutiva a la que se llega al comparar composiciones repetidas difiere de la encontrada al comparar secuencias no repetidas. [6] Se cree que las matrices repetidas de TALE evolucionan rápidamente, y se sugiere una serie de procesos recombinatorios para dar forma a la evolución de las matrices repetidas. [5] La recombinación de matrices repetidas de TALE se ha demostrado en un experimento de selección forzada. [9] Se cree que este dinamismo evolutivo es posible gracias a la muy alta identidad de secuencia de las repeticiones de TALE, que es una característica única de los TALE a diferencia de otros tipos de TALE.
Otra característica única de los TALE es un conjunto de cuatro estructuras repetidas en el flanco N-terminal de la matriz de repetición central. Se ha demostrado que estas estructuras, denominadas repeticiones no canónicas o degeneradas, son vitales para la unión del ADN, [10] aunque todas menos una no entran en contacto con las bases del ADN y, por lo tanto, no contribuyen a la preferencia de secuencia. La única excepción es la repetición -1, que codifica una preferencia T-cero fija para todos los TALE. Esto significa que las secuencias objetivo de TALE siempre están precedidas por una base de timina. Se cree que esto es común a todos los TALE, con la posible excepción del TalC de Xanthomonas oryzae pv. oryzae cepa AXO1947 ( G1FM79 ). [11]
En la publicación de 2002 del genoma de la cepa de referencia Ralstonia solanacearum GMI1000 se observó que su genoma codifica una proteína similar a Xanthomonas TALE. [12] Basándose en una estructura de dominio similar y secuencias repetidas, se supuso que este gen y sus homólogos en otras cepas de Ralstonia codificarían proteínas con las mismas propiedades moleculares que los TALE, incluida la unión de ADN de secuencia específica. En 2013 esto fue confirmado por dos estudios. [13] [14] Estos genes y las proteínas que codifican se denominan RipTAL (proteína inyectada con Ralstonia similar a TALE) de acuerdo con la nomenclatura estándar de los efectores de Ralstonia. [15] Si bien el código de unión al ADN de las repeticiones centrales se conserva con los TALE, los RipTAL no comparten la preferencia T-cero, sino que tienen un requisito estricto de G-cero. [13] Además, las repeticiones dentro de una única matriz de repeticiones RipTAL tienen múltiples diferencias de secuencia más allá de las posiciones RVD, a diferencia de las repeticiones casi idénticas de TALE.
Se han encontrado RipTAL en los cuatro filotipos de R. solanacearum , lo que los convierte en una característica ancestral de este clado. A pesar de las diferencias en los dominios flanqueantes, las secuencias a las que se dirigen los RVD son muy similares. [dieciséis]
Varias líneas de evidencia respaldan la idea de que los RipTAL funcionan como proteínas efectoras, promoviendo el crecimiento bacteriano o la enfermedad mediante la manipulación de la expresión de genes vegetales. Son secretadas en las células vegetales mediante el sistema de secreción tipo III , que es el principal sistema de administración de proteínas efectoras. [17] Se localizan en el núcleo celular y pueden funcionar como factores de transcripción de secuencia específica en células vegetales. [13] Además, se demostró que una cepa que carecía de RipTAL crecía más lentamente dentro del tejido de la hoja de berenjena que el tipo salvaje. [18] Además, un estudio basado en polimorfismos de ADN en secuencias de dominios repetidos ripTAL y plantas huésped encontró una conexión estadísticamente significativa entre la planta huésped y las variantes del dominio repetido. [19] Esto es de esperar si los RipTAL de diferentes cepas se adaptan a genes diana en plantas hospedantes específicas. A pesar de esto, no se han identificado genes diana para ningún RipTAL, hasta junio de 2019 [actualizar].
La publicación del genoma de la cepa bacteriana Paraburkholderia rhizoxinica HKI 454, en 2011 [20] condujo al descubrimiento de un conjunto de genes similares a TALE que diferían considerablemente en su naturaleza de los TALE y RipTALS. Las proteínas codificadas por estos genes fueron estudiadas por sus propiedades de unión al ADN por dos grupos de forma independiente y las denominaron Murciélagos (Burkholderia TALE-likes; E5AV36 ) o BurrH. [21] [22] Esta investigación demostró que las unidades repetidas de los tipos TALE de Burkholderia se unen al ADN con el mismo código que los TALE, gobernados por la posición 13 de cada repetición. Sin embargo, existen una serie de diferencias.
Los TALE-likes de Burkholderia están compuestos casi en su totalidad por repeticiones, y carecen de los grandes dominios no repetitivos que se encuentran flanqueando las repeticiones en TALE y RpTAL. Esos dominios son clave para las funciones de TALE y RipTAL, permitiéndoles infiltrarse en el núcleo de la planta y activar la expresión genética. Por lo tanto, actualmente no está claro cuáles son las funciones biológicas de los tipos TALE de Burkholderia . Lo que está claro es que no son proteínas efectoras secretadas en células vegetales para actuar como factores de transcripción, el papel biológico de los TALE y RipTAL. No es inesperado que puedan diferir en sus funciones biológicas de las TALE y RipTAL, ya que el estilo de vida de la bacteria de la que derivan es muy diferente al de las bacterias portadoras de TALE y RipTAL. B. rhizoxinica es un endosimbionte que vive dentro de un hongo, a diferencia de Rhizopus microsporus , un patógeno vegetal. El mismo hongo es también un patógeno humano oportunista en pacientes inmunocomprometidos, pero mientras que B. rhizoxinica es necesaria para la patogenicidad en plantas hospedantes, es irrelevante para la infección humana. [23] No está claro si los tipos Burkholderia TALE se secretan alguna vez en el hongo, y mucho menos en las plantas hospedantes.
Como se señala en las publicaciones sobre los tipos TALE de Burkholderia , puede haber algunas ventajas al usar estas proteínas como andamio para que las proteínas programables de unión al ADN funcionen como factores de transcripción o nucleasas de diseño, en comparación con los TALE. [21] [22] Se ha fusionado con una nucleasa FokI análoga a TALEN . [3] Las ventajas incluyen un tamaño de repetición más corto, una estructura de dominio más compacta (sin dominios grandes que no se repiten), una mayor diversidad de secuencias repetidas que permite el uso de PCR en los genes que los codifican y los hace menos vulnerables a la pérdida de repeticiones recombinatorias. Además, los tipos Burkholderia TALE no tienen ningún requisito de T-cero que relaje las limitaciones en la selección de objetivos de ADN. Sin embargo, se han publicado pocos usos de Burkholderia TALE-likes como proteínas programables de unión al ADN, fuera de las publicaciones de caracterización originales.
En 2007, los resultados de un barrido metagenómico de los océanos del mundo realizado por el Instituto J. Craig Venter se hicieron públicos. [24] El artículo de 2014 sobre Burkholderia TALE-likes [22] también fue el primero en informar que dos entradas de esa base de datos se parecían a TALE-likes, basándose en la similitud de secuencia. Estos se caracterizaron y evaluaron aún más por su potencial de unión al ADN en 2015. [25] Se descubrió que las unidades repetidas codificadas por estas secuencias mediaban la unión al ADN con una preferencia de base que coincidía con el código TALE, y se consideró probable que formaran estructuras casi idénticas a las repeticiones de Bat1. basado en simulaciones de dinámica molecular . Por lo tanto, las proteínas codificadas por estas secuencias de ADN se denominaron Organismos Marinos similares a TALE (MOrTL) 1 y 2 ( GenBank : ECG96325 , EBN91409 ). [25] Secuencias similares encontradas en metagenomas incluyen EBN19408 y ECR81667 . [26]
Si bien las repeticiones de MOrTL1 y 2 se ajustan estructural y funcionalmente a la norma similar a TALE, difieren considerablemente a nivel de secuencia tanto de todos los demás tipos TALE como entre sí. No se sabe si son verdaderamente homólogos de otros tipos de TALE y, por lo tanto, constituyen, junto con TALE, RipTAL y Bats, una verdadera familia de proteínas . Alternativamente, es posible que hayan evolucionado de forma independiente. Es particularmente difícil juzgar la relación con otros tipos de TALE porque no se sabe casi nada de los organismos de los que provienen MOrTL1 y MOrTL2. Sólo se sabe que se encontraron en dos muestras separadas de agua de mar del Golfo de México y que es probable que sean bacterias basadas en la exclusión por tamaño antes de la secuenciación del ADN. [25]
En julio de 2012 se presentó una patente para BAT y similares a TALE marinos en ingeniería de proteínas. En mayo de 2019 [actualizar], actualmente está pendiente en todas las jurisdicciones. [27]