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Renilla-luciferina 2-monooxigenasa

La luciferasa de Renilla 2-monooxigenasa , luciferasa de Renilla o RLuc , es una enzima bioluminiscente que se encuentra en Renilla reniformis y pertenece a un grupo de luciferasas de coelenterazina . De este grupo de enzimas, la luciferasa de Renilla reniformis ha sido la más estudiada y, debido a que su bioluminiscencia requiere solo oxígeno molecular, tiene una amplia gama de aplicaciones, con usos como sonda de gen reportero en cultivos celulares, imágenes in vivo y varias otras áreas de investigación biológica. [2] Recientemente, se han desarrollado quimeras de RLuc y se ha demostrado que son las proteínas luminiscentes más brillantes hasta la fecha, y han demostrado ser efectivas tanto en imágenes no invasivas de células individuales como de cuerpo entero. [3]

Tenga en cuenta que el registro EC también incluye otras enzimas no relacionadas que catalizan la misma reacción. Un ejemplo es la fotoproteína dependiente de calcio aequorina : mientras que Rluc está en la superfamilia de hidrolasas AB , la aequorina es una proteína de mano EF . [4] El nombre no se refiere específicamente a Renilla , sino que se refiere a Renilla-luciferina, una sustancia química también conocida como coelenterazina.

Reacción química

RLuc es una oxidorreductasa que actúa específicamente sobre donantes únicos con O2 como oxidante. Sin embargo, esta enzima parece no estar relacionada con la mayoría de las otras luciferasas que actúan sobre la coelenterazina, como las de los copépodos . RLuc cataliza la reacción química

Coelenterazina + O 2 coelenteramida + CO 2 + hν

En el proceso, la coelenterazina se oxida con una pérdida simultánea de CO 2 y se emite un fotón de luz azul. [5]

Función biológica

En Renilla reniformis , RLuc se encuentra en estructuras intracelulares unidas a la membrana dentro de células especializadas emisoras de luz, [6] [7] y está acoplado con una proteína fluorescente verde de interacción cercana (RrGFP), [8] y una proteína de unión a luciferina activada por Ca ++ (RrLBP). [9] Aunque la oxidación catalizada por luciferasa de la coelenterazina libera un fotón de luz azul (480 nm), esto no se observa in vivo . En cambio, la energía liberada por la reacción que involucra a RLuc pasa a través de la transferencia de energía de resonancia al fluoróforo de RrGFP y se emite como un fotón verde (505 nm), [10] lo que resulta en la bioluminiscencia verde observada desde el animal. Este proceso se basa en un mecanismo de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), que aumenta el número de fotones emitidos aproximadamente seis veces. [11]

Estructura

La luciferasa de Renilla contiene 311 aminoácidos , [1] y es activa como un monómero de cadena polipeptídica única casi esférica de 36 kDa , que tiene una tendencia a la autoasociación, formando dímeros y trímeros inactivos. [12] [13] Al igual que otras enzimas de la superfamilia de deshalogenasas , tiene una secuencia de plegamiento de α/β-hidrolasa característica en su núcleo [14] y comparte la tríada catalítica conservada de residuos empleados por las deshalogenasas. [15] En RLuc, el bucle que contiene los residuos 153-163 es estructuralmente flexible, lo que facilita una mayor difusión de solventes en el sitio activo, que contiene una tríada catalítica altamente conservada que consiste en ácido aspártico en el residuo 120, ácido glutámico en el residuo 144 e histidina en el residuo 285. [1]

Vía enzimática

A diferencia de las fotoproteínas que se unen de forma estable a la coelenterazina y emiten luz tras la adición de calcio, la coelenterazina normalmente se une a la RrLBP, la proteína de unión a la luciferina. Cuando se estimula, un ion Ca 2+ interactúa primero con RrLBP, lo que hace que libere coelenterazina. [9] Luego, la coelenterazina es oxidada por RLuc en coelenteramida , liberando un solo fotón de luz azul (480 nm) en el proceso. Este fotón es capturado por la GFP adyacente, liberando un fotón de luz verde . Esta vía se resume a continuación.

Mecanismo

La reacción química mediada por RLuc implica la degradación catalítica de la coelenterazina y se lleva a cabo a través de un intermediario de 1,2- dioxetano (también llamado dioxetanona o peróxido cíclico). [16] Con base en estudios que utilizan especies de oxígeno marcadas radiactivamente dentro del complejo RLuc, se ha determinado que el oxígeno del carbonilo de la luciferina se intercambia rápidamente con el oxígeno del agua antes de la incorporación de un átomo de oxígeno del O2 a través de un intermediario de dioxetano . El CO2 resultante también intercambia rápidamente sus oxígenos con los del agua circundante. [17] El mecanismo general se describe a continuación.

Mecanismo de la luciferasa de Renilla y su conversión de coelenterazina a coelenteramida, CO2 y un fotón de luz
Mecanismo de la luciferasa de Renilla y su conversión de coelenterazina a coelenteramida, CO2 y un fotón de luz

Referencias

  1. ^ abc Loening AM, Fenn TD, Gambhir SS (diciembre de 2007). "Estructuras cristalinas de la luciferasa y la proteína fluorescente verde de Renilla reniformis". Journal of Molecular Biology . 374 (4): 1017–28. doi :10.1016/j.jmb.2007.09.078. PMC 2700051 . PMID  17980388. 
  2. ^ Daunert, Sylvia (2006). Fotoproteínas en bioanálisis . John Wiley & Sons.
  3. ^ Saito K, Chang YF, Horikawa K, Hatsugai N, Higuchi Y, Hashida M, Yoshida Y, Matsuda T, Arai Y, Nagai T (11 de diciembre de 2012). "Proteínas luminiscentes para imágenes de alta velocidad de células individuales y de cuerpo entero". Nature Communications . 3 : 1262. Bibcode :2012NatCo...3.1262S. doi :10.1038/ncomms2248. PMC 3535334 . PMID  23232392. 
  4. ^ MetaCyc apoaequorina-1
  5. ^ Schomburg, Dietmar (1994). Manual de enzimas . Springer.
  6. ^ Anderson JM, Cormier MJ (abril de 1973). "Lumisomas, el sitio celular de bioluminiscencia en celentéreos". The Journal of Biological Chemistry . 248 (8): 2937–43. doi : 10.1016/S0021-9258(19)44098-2 . PMID  4144548.
  7. ^ Spurlock BO, Cormier MJ (enero de 1975). "Un estudio de la estructura fina del antocodio en Renilla mülleri. Evidencia de la existencia de un orgánulo bioluminiscente, la luminela". The Journal of Cell Biology . 64 (1): 15–28. doi :10.1083/jcb.64.1.15. PMC 2109472 . PMID  233975. 
  8. ^ Ward WW, Cormier MJ (febrero de 1979). "Una proteína de transferencia de energía en la bioluminiscencia de celentéreos. Caracterización de la proteína verde fluorescente de Renilla". The Journal of Biological Chemistry . 254 (3): 781–8. doi : 10.1016/S0021-9258(17)37873-0 . PMID  33175.
  9. ^ ab Inouye S (marzo de 2007). "Expresión, purificación y caracterización de la proteína de unión a luciferina activada por calcio de Renilla reniformis". Expresión y purificación de proteínas . 52 (1): 66–73. doi :10.1016/j.pep.2006.07.028. PMID  16997571.
  10. ^ Martel C, Dugré-Brisson S, Boulay K, Breton B, Lapointe G, Armando S, Trépanier V, Duchaîne T, Bouvier M, Desgroseillers L (marzo de 2010). "Multimerización de Staufen1 en células vivas". ARN . 16 (3): 585–97. doi :10.1111/j.1751-1097.1978.tb07621.x. PMC 2822923 . PMID  20075165. 
  11. ^ Ward WW, Cormier MJ (septiembre de 1976). "Transferencia de energía in vitro en bioluminiscencia de Renilla". The Journal of Physical Chemistry . 80 (20): 2289–91. doi :10.1021/j100561a030.
  12. ^ Matthews JC, Hori K, Cormier MJ (enero de 1977). "Purificación y propiedades de la luciferasa de Renilla reniformis". Bioquímica . 16 (1): 85–91. doi :10.1021/bi00620a014. PMID  12797.
  13. ^ Karkhanis YD, Cormier MJ (enero de 1971). "Aislamiento y propiedades de la luciferasa de Renilla reniformis, una enzima de conversión de energía de bajo peso molecular". Bioquímica . 10 (2): 317–26. doi :10.1021/bi00778a019. PMID  4395343.
  14. ^ Ollis DL, Cheah E, Cygler M, Dijkstra B, Frolow F, Franken SM, Harel M, Remington SJ, Silman I, Schrag J (abril de 1992). "El plegamiento de la alfa/beta hidrolasa" (PDF) . Ingeniería de proteínas . 5 (3): 197–211. doi :10.1093/protein/5.3.197. hdl : 11370/2d4c057d-1a67-437d-ad10-701f7a60f1e6 . PMID  1409539.
  15. ^ Loening AM, Fenn TD, Wu AM, Gambhir SS (septiembre de 2006). "La mutagénesis guiada por consenso de la luciferasa de Renilla produce una mayor estabilidad y salida de luz". Ingeniería, diseño y selección de proteínas . 19 (9): 391–400. doi : 10.1093/protein/gzl023 . PMID  16857694.
  16. ^ Anderson JM, Charbonneau H, Cormier MJ (marzo de 1974). "Mecanismo de inducción de la bioluminiscencia de Renilla por calcio. Participación de una proteína de unión a luciferina activada por calcio". Bioquímica . 13 (6): 1195–200. doi :10.1021/bi00703a602. PMID  4149963.
  17. ^ Hart RC, Stempel KE, Boyer PD, Cormier MJ (abril de 1978). "Mecanismo de la oxidación bioluminiscente catalizada por enzimas de la luciferina de tipo celentéreo". Biochemical and Biophysical Research Communications . 81 (3): 980–6. doi :10.1016/0006-291X(78)91447-X. PMID  27179.