El bacteriófago T7 (o el fago T7 ) es un bacteriófago , un virus que infecta bacterias. Infecta la mayoría de las cepas de Escherichia coli y depende de estos huéspedes para propagarse. El bacteriófago T7 tiene un ciclo de vida lítico , lo que significa que destruye la célula que infecta. También posee varias propiedades que lo convierten en un fago ideal para la experimentación: su purificación y concentración han producido valores consistentes en los análisis químicos; [2] puede dejar de ser infeccioso mediante la exposición a la luz ultravioleta; [3] y se puede utilizar en la presentación de fagos para clonar proteínas de unión a ARN . [3]
En un estudio de 1945 realizado por Demerec y Fano, [4] se utilizó T7 para describir uno de los siete tipos de fagos (T1 a T7) que crecen líticamente en Escherichia coli . [5] Aunque los siete fagos estaban numerados arbitrariamente, más tarde se descubrió que los fagos con números impares, o fagos T impares, compartían características morfológicas y bioquímicas que los distinguen de los fagos T pares. [6] Antes de ser denominado físicamente T7, el fago se utilizó en experimentos anteriores. El biofísico alemán-estadounidense Max Delbrück trabajó con el mismo virus a fines de la década de 1930, llamándolo fago δ, y el microbiólogo franco-canadiense Félix d'Herelle probablemente estudió su pariente cercano en la década de 1920. [7] [5]
T7 crece en cepas rugosas de Escherichia coli (es decir, aquellas sin polisacárido de antígeno O completo en su superficie) y algunas otras bacterias entéricas , pero sus parientes cercanos también infectan cepas lisas e incluso encapsuladas. [8]
El virus tiene una simetría estructural compleja, con una cápside del fago que es icosaédrica (veinte caras) con un diámetro interior de 55 nm y una cola de 19 nm de diámetro y 28,5 nm de largo unida a la cápside. [9] La expulsión de proteínas de la cápside tras la infección hace que el virus cambie de estructura cuando ingresa a la célula. [10]
El genoma del fago T7 [11] estuvo entre los primeros genomas completamente secuenciados y se publicó en 1983. [12] La cabeza de la partícula del fago contiene el genoma de ADNbc de aproximadamente 40 kpb que codifica 55 proteínas. [13] El genoma presenta numerosos genes superpuestos [14] que se eliminaron parcialmente mediante la "refactorización" del genoma para producir T7.1. [15]
![Vista esquemática del genoma del fago T7. Las cajas son genes, los números son números de genes. Los colores indican grupos funcionales como se muestra. Los cuadros blancos son genes de función desconocida o sin anotación. Modificado después de [5]](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/db/T7_phage_genome.png/1280px-T7_phage_genome.png)
T7 tiene un ciclo de vida de 17 min a 37˚C, es decir, el tiempo desde la infección hasta la lisis de la célula huésped cuando se liberan nuevos fagos. Debido al corto período de latencia , la mayoría de los estudios fisiológicos se realizan a 30 ˚C, donde las células infectadas se lisan después de 30 minutos. Sin embargo, se han aislado cepas de T7 de alta aptitud física con un período de latencia de solo ~ 11 minutos a 37 ° C y crecen en condiciones óptimas en resultados de medios ricos. Este fago adaptado puede sufrir una expansión efectiva de su población de más de 10 13 en una hora de crecimiento. [dieciséis]
El fago T7 reconoce ciertos receptores en la superficie de las células de E. coli y se une a la superficie celular mediante las fibras de su cola viral. En algunas cepas de T7, las fibras de la cola se reemplazan con púas de la cola que degradan los antígenos O o K en la superficie celular mediante actividad enzimática . [5]
El proceso de adsorción y penetración utiliza lisozimas para crear una abertura dentro de la capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana, lo que permite la transferencia del ADN viral al interior de la bacteria. La cola corta y rechoncha del fago tipo T7 es demasiado corta para abarcar la envoltura celular y, para expulsar el genoma del fago al interior de la célula al inicio de la infección, las proteínas del virión primero deben crear un canal desde la punta de la cola. hacia el citoplasma celular. [17] El fago también libera cinco proteínas necesarias para comenzar la replicación del genoma viral y escindir el genoma del huésped. [18] El bacteriófago T7 ha evolucionado para anular varias de las defensas de la bacteria huésped, incluida la pared celular de peptidoglicano y el sistema CRISPR . [18] Una vez que el fago T7 ha insertado el genoma viral, el proceso de replicación del ADN del genoma del huésped se detiene y comienza la replicación del genoma viral. [19]
En condiciones óptimas, el fago T7 puede completar el proceso lítico en 25 minutos, lo que provoca la muerte de la célula huésped de E. coli . En el momento de la lisis, el virus puede producir más de 100 descendientes. [18]
Gp5 (codificada por el gen gp5 ) es la ADN polimerasa T7 . La ADN polimerasa T7 utiliza la tioredoxina endógena de E. coli , una proteína REDOX, como abrazadera deslizante del ADN durante la replicación del ADN del fago (aunque la tioredoxina normalmente tiene una función diferente). La abrazadera deslizante funciona para sujetar la polimerasa al ADN, lo que aumenta la velocidad de síntesis. [20]
El fago T7 tiene el replisoma de ADN más simple conocido , que consiste en una helicasa y primasa que residen en una única cadena polipeptídica que forma un hexámero en presencia de ADN y ATP o dTTP . La ADN polimerasa T7, asistida por tiorredoxina de E. coli , realiza la síntesis de ADN tanto de cadena líder como rezagada .
En el fago T7, las roturas de la doble cadena del ADN probablemente se reparan mediante la inserción de un parche de ADN del donante en un espacio en el sitio de la rotura. [21] Esta reparación de roturas de doble hebra es facilitada por la proteína del gen 2.5 que promueve la hibridación de hebras complementarias homólogas de ADN . [22]
El ADN intracelular replicante del fago T7, cuando se estira después de la lisis celular, suele ser más largo que el cromosoma del fago maduro (11 a 15 μM) y puede presentarse en forma de hebras lineales altamente concatenadas de hasta 66 veces la longitud del fago maduro. cromosoma. [23] El ADN en replicación también se puede ver en forma de estructuras de anillos enrollados que parecen corresponder a configuraciones de ADN con bucles múltiples en las que los giros superhelicoidales, necesarios para la compactación del ADN, se aliviaron mediante mellas en las hebras durante la lisis celular. [23]
La secuencia del promotor T7 se utiliza ampliamente en biología molecular debido a su extremadamente alta afinidad por la ARN polimerasa de T7 y, por tanto, su alto nivel de expresión. [3] [2]
T7 se ha utilizado como modelo en biología sintética . Chan et al. (2005) " refactorizaron " el genoma de T7, reemplazando aproximadamente 12 kpb de su genoma con ADN diseñado. [15] El ADN modificado se diseñó para que fuera más fácil trabajar con él de varias maneras: los elementos funcionales individuales se separaron mediante sitios de endonucleasa de restricción para una modificación simple, y los dominios codificantes de proteínas superpuestos se separaron y, cuando fue necesario, se modificaron mediante un solo par de bases. mutaciones silenciosas .