La ADN polimerasa T7 es una enzima utilizada durante la replicación del ADN del bacteriófago T7 . Durante este proceso, la ADN polimerasa “lee” las cadenas de ADN existentes y crea dos nuevas cadenas que coinciden con las existentes. La ADN polimerasa T7 requiere un factor huésped, la tiorredoxina de E. coli , [1] para llevar a cabo su función. Esto ayuda a estabilizar la unión de la proteína necesaria al cebador-molde para mejorar la procesividad en más de 100 veces, que es una característica exclusiva de esta enzima. [2] Es un miembro de las ADN polimerasas de la Familia A, que incluyen la ADN polimerasa I de E. coli y la ADN polimerasa Taq .
Esta polimerasa tiene varias aplicaciones en mutagénesis dirigida al sitio [3] , así como una enzima de alta fidelidad adecuada para PCR . [4] También ha servido como precursora de Sequenase, [5] una enzima diseñada y optimizada para la secuenciación de ADN . [6]
Figura 2. Transferencia de nucleótidos por la ADN polimerasa.
La ADN polimerasa T7 cataliza la transferencia de fosforilo [7] durante la replicación del ADN del fago T7 . Como se muestra en la Figura 2 , el grupo hidroxilo 3' de un cebador actúa como un nucleófilo y ataca el enlace fosfodiéster del nucleósido 5'-trifosfato (dTMP-PP). Esta reacción agrega un nucleósido monofosfato al ADN y libera un pirofosfato (PPi). Generalmente, la reacción depende del metal y los cationes como Mg 2+ suelen estar presentes en el sitio activo de la enzima. [7]
Para la ADN polimerasa T7, los dedos, la palma y el pulgar ( Figura 1 ) posicionan el cebador-plantilla de modo que el extremo 3' de la cadena del cebador se posicione junto al sitio de unión del nucleótido (ubicado en la intersección de los dedos y el pulgar). [8] El par de bases formado entre el nucleótido y la base de la plantilla encaja perfectamente en una ranura entre los dedos y el extremo 3' del cebador. [8] Dos iones Mg 2+ forman una red de coordenadas octaédrica con el ligando de oxígeno y también acercan el hidroxilo del cebador reactivo y el nucleótido α-fosfato, lo que reduce el costo entrópico de la adición nucleofílica . [8] El paso limitante de la velocidad en el ciclo catalítico ocurre después de que el trifosfato de nucleósido se une y antes de que se incorpore al ADN (que corresponde al cierre del subdominio de los dedos alrededor del ADN y el nucleótido). [8]
Los aminoácidos presentes en el sitio activo ayudan a crear un entorno estabilizador para que la reacción se lleve a cabo. Los aminoácidos como Lys522 , Tyr526 , His506 y Arg518 actúan como donantes de enlaces de hidrógeno . El carbonilo de la cadena principal de Ala476 , Asp475 y Asp654 forma enlaces coordinados con los iones Mg2 + .
Asp475 y Asp654 forman un puente con los cationes Mg2 + para orientarlos adecuadamente. El ion Mg2 + de la derecha ( Figura 3 ) interactúa con oxígenos cargados negativamente de los fosfatos alfa(α), beta(β) y gamma(γ) para alinear el enlace escindible para que el cebador ataque. [8] Incluso si no hay una base general dentro del sitio activo para desprotonar el hidroxilo del cebador, el pka reducido del hidroxilo unido al metal favorece la formación del nucleófilo 3'-hidróxido. [8] Los iones metálicos y Lys522 entran en contacto con oxígenos que no forman puentes en el α-fosfato para estabilizar la carga negativa que se desarrolla en el α-fósforo durante la formación del enlace con el nucleófilo.
Además, la cadena lateral Lys522 también se mueve para neutralizar el grupo pirofosfato cargado negativamente. Las cadenas laterales Tyr526, His506, Arg518 y el oxígeno del grupo carbonilo de la cadena principal de Ala476 participan en la red de enlaces de hidrógeno y ayudan a alinear el sustrato para la transferencia de fosforilo. [8]
Si bien el fago T7 media la replicación del ADN de una manera muy similar a la de los organismos superiores, el sistema T7 es generalmente más simple en comparación con otros sistemas de replicación. Además de la ADN polimerasa T7 (también conocida como gp5), el replisoma T7 requiere solo cuatro proteínas accesorias para funcionar correctamente: tiorredoxina del huésped, gp4, gp2.5 y gp1.7.
La polimerasa T7 por sí misma tiene una procesividad muy baja . Se disocia del cebador -molde después de incorporar unos 15 nucleótidos. Tras la infección del huésped, la polimerasa T7 se une a la tiorredoxina del huésped en una proporción de 1:1. La interacción hidrofóbica entre la tiorredoxina y la polimerasa T7 ayuda a estabilizar la unión de la polimerasa T7 al cebador -molde. Además, la unión de la tiorredoxina aumenta la procesividad de la polimerasa T7 a casi 80 veces. [9] El mecanismo preciso por el cual el complejo tiorredoxina-polimerasa T7 es capaz de lograr tal aumento en la procesividad aún se desconoce. La unión de la tiorredoxina expone una gran cantidad de residuos de aminoácidos básicos en la región del pulgar de la polimerasa T7. Varios estudios sugieren que la interacción electrostática entre estos residuos básicos cargados positivamente con la cadena principal de fosfato cargada negativamente del ADN y otras proteínas accesorias es responsable del aumento de la procesividad en el complejo gp5/tiorredoxina. [9] [10] [11]
gp4 es una proteína hexamérica que contiene dos dominios funcionales: el dominio de la helicasa y el dominio de la primasa . El dominio de la helicasa desenrolla el ADN bicatenario para proporcionar una plantilla para la replicación. La cola C-terminal del dominio de la helicasa contiene varios residuos ácidos cargados negativamente que hacen contacto con el residuo básico expuesto de la polimerasa T7/tiorredoxina. Estas interacciones ayudan a cargar el complejo polimerasa T7/tiorredoxina en la horquilla de replicación . El dominio de la primasa cataliza la síntesis de oligorribonucleótidos cortos . Estos oligorribonucleótidos, llamados cebadores , son complementarios a la cadena de plantilla y se utilizan para iniciar la replicación del ADN . En el sistema T7, el dominio de las primasas de una subunidad interactúa con el dominio de las primasas de la subunidad adyacente. Esta interacción entre los dominios de las primasas actúa como un freno para detener la helicasa cuando es necesario, lo que garantiza la síntesis de la cadena líder al mismo ritmo que la síntesis de la cadena rezagada . [11]
gp2.5 tiene una función similar a la proteína de unión al ADN monocatenario . gp2.5 protege el ADN monocatenario producido durante la replicación y coordina la síntesis de las cadenas líder y rezagada a través de la interacción entre su cola C-terminal ácida y gp5/tiorredoxina. [11]
gp1.7 es una quinasa de monofosfato de nucleósido que cataliza la conversión de desoxinucleósidos 5'-monofosfatos en nucleótidos di y trifosfato, lo que explica la sensibilidad de la polimerasa T7 a los didesoxinucleótidos (ver Sequenasa a continuación). [11]
La subunidad primaria gp5 de la ADN polimerasa T7 por sí sola tiene una procesividad baja y se disocia del ADN después de la incorporación de tan solo unos pocos nucleótidos. Para volverse procesivamente eficiente, la ADN polimerasa T7 recluta tiorredoxina del huésped para formar un complejo tiorredoxina-gp5. La tiorredoxina se une al dominio de unión de tiorredoxina de gp5, estabilizando así una región de unión de ADN flexible de gp5. La estabilización de esta región de gp5 aumenta alostéricamente la cantidad de interacción de la superficie de la proteína con la porción dúplex del cebador-molde. El complejo tiorredoxina-gp5 resultante aumenta la afinidad de la polimerasa T7 por el extremo terminal del cebador en aproximadamente 80 veces y actúa de manera procesiva alrededor de los 800 pasos de incorporación de nucleótidos. [12]
El mecanismo adoptado por la polimerasa T7 para lograr su procesividad difiere de muchas otras polimerasas en que no depende de una pinza de ADN o un cargador de pinza. En cambio, el complejo de la polimerasa de ADN T7 requiere solo tres proteínas para la polimerización procesiva del ADN: la polimerasa T7 (gp5), la tiorredoxina de Escherichia coli y la proteína de unión al ADN monocatenario gp2.5. [13] Aunque estas tres proteínas son las únicas necesarias para la polimerización del ADN monocatenario de plantilla, en un entorno biológico nativo la tiorredoxina-gp5 interactúa con la helicasa gp4, que proporciona una plantilla de ADN monocatenario (figura 4). Durante la síntesis de la cadena líder, la tiorredoxina-gp5 y la gp4 forman un complejo de alta afinidad que aumenta la procesividad general de la polimerasa a alrededor de 5 kb. [14] [15]
La ADN polimerasa T7 posee una actividad exonucleasa de ADN monocatenario y bicatenario de 3' a 5' . Esta actividad exonucleasa se activa cuando una base recién sintetizada no se aparea correctamente con la cadena molde. La escisión de bases incorporadas incorrectamente actúa como un mecanismo de corrección, lo que aumenta la fidelidad de la ADN polimerasa T7. [4] Durante la caracterización temprana de la actividad exonucleasa, se descubrió que la oxidación catalizada por hierro de la ADN polimerasa T7 producía una enzima modificada con una actividad exonucleasa muy reducida. Este descubrimiento condujo al desarrollo y uso de la ADN polimerasa T7 como una secuenciasa en los primeros métodos de secuenciación de ADN. [16]
El mecanismo por el cual la ADN polimerasa T7 detecta que se ha incorporado una base no coincidente es todavía un tema de estudio. Sin embargo, algunos estudios han proporcionado evidencia que sugiere que los cambios en la tensión de la cadena de ADN molde causados por la falta de coincidencia de pares de bases pueden inducir la activación de la exonucleasa. Wuite et al. observaron que la aplicación de una tensión de más de 40 pN al ADN molde resultó en un aumento de 100 veces en la actividad de la exonucleasa. [17]
La mutagénesis dirigida es un método de biología molecular que se utiliza para realizar cambios específicos e intencionales en la secuencia de ADN de un gen y cualquier producto génico . La técnica se desarrolló en un momento en el que la ADN polimerasa de mayor calidad disponible comercialmente para convertir un oligonucleótido en una cadena de ADN complementaria completa era el fragmento grande (Klenow) de la ADN polimerasa 1 de E. coli. Sin embargo, el paso de ligadura puede convertirse en un problema con la mutagénesis de oligonucleótidos. Esto es cuando la ADN ligasa opera de manera ineficiente en relación con la ADN polimerasa, el desplazamiento de la cadena del oligonucleótido puede reducir la frecuencia mutante. Por otro lado, la ADN polimerasa T7 no realiza la síntesis por desplazamiento de la cadena; y por lo tanto, se puede utilizar para obtener altas frecuencias mutantes para mutantes puntuales independientemente de la ligadura. [18]
La clonación de ADNc es una tecnología importante para el análisis de la expresión de genomas. La primera hebra completa se puede sintetizar mediante transcriptasas inversas disponibles comercialmente. La síntesis de la segunda hebra fue una limitación importante para la clonación de ADNc. Se desarrollaron dos grupos de métodos que difieren en el mecanismo de iniciación para sintetizar la segunda hebra. En un primer grupo de métodos, la iniciación de la síntesis de la segunda hebra tiene lugar dentro de la secuencia de la primera hebra. Sin embargo, se requiere la digestión del extremo 3' de la primera hebra y, por lo tanto, da como resultado la pérdida de las secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNm. En un segundo grupo de métodos, la iniciación de la síntesis de la segunda hebra tiene lugar fuera de la secuencia de la primera hebra. Este grupo de métodos no requiere la digestión del extremo 3' de la primera hebra. Sin embargo, la limitación de este grupo de métodos radica en la elongación. La clonación con la ADN polimerasa T7 ayuda a superar esta limitación al permitir la digestión del tracto poli(dT) durante la reacción de síntesis de la segunda hebra. Por lo tanto, no es necesario que el tamaño del tracto sintetizado con la transferasa terminal se encuentre dentro de un rango de tamaño determinado y los clones resultantes contienen un tracto de un tamaño limitado. Además, debido a la alta actividad de la exonucleasa 3' de la ADN polimerasa T7, se puede obtener un alto rendimiento de la segunda cadena de longitud completa. [19]
En la secuenciación de Sanger , uno de los principales problemas de las ADN polimerasas es la discriminación de los didesoxinucleótidos, los nucleótidos que terminan la cadena. La mayoría de las ADN polimerasas conocidas discriminan fuertemente a los ddNTP; y por lo tanto, se debe utilizar una alta proporción de ddNTP a dNTP para una terminación de cadena eficiente. La ADN polimerasa T7 discrimina a los ddNTP solo varias veces; y por lo tanto, requiere una concentración mucho menor de ddNTP para proporcionar una alta uniformidad de bandas de ADN en el gel. Sin embargo, su fuerte actividad exonucleasa 3'-5' puede alterar la secuenciación ya que cuando la concentración de dNTP cae, la actividad exonucleasa aumenta, lo que resulta en la ausencia de síntesis neta de ADN o degradación del ADN. Para usarla en la secuenciación de ADN, la ADN polimerasa T7 se ha modificado para eliminar su actividad exonucleasa, ya sea químicamente (Sequenase 1.0) o por eliminación de residuos (Sequenase Versión 2.0). [4] [20]
