En genética , el ADN complementario ( ADNc ) es ADN que se transcribió de forma inversa (a través de la transcriptasa inversa ) a partir de un ARN (por ejemplo, ARN mensajero o microARN ). El ADNc existe en forma monocatenaria y bicatenaria y en forma natural y modificada.
En las formas diseñadas, a menudo es una copia (réplica) del ADN natural del genoma natural de un organismo en particular; el ARNm del propio organismo se transcribió naturalmente a partir de su ADN, y el ADNc se transcribe de forma inversa a partir del ARNm, lo que produce un duplicado del ADN original. El ADNc diseñado a menudo se utiliza para expresar una proteína específica en una célula que normalmente no expresa esa proteína (es decir, expresión heteróloga ), o para secuenciar o cuantificar moléculas de ARNm utilizando métodos basados en ADN (qPCR, RNA-seq). El ADNc que codifica una proteína específica se puede transferir a una célula receptora para su expresión como parte del ADN recombinante , a menudo sistemas de expresión bacterianos o de levadura. [1] El ADNc también se genera para analizar perfiles transcriptómicos en tejido a granel, células individuales o núcleos individuales en ensayos como microarrays , qPCR y RNA-seq .
En formas naturales, el ADNc es producido por retrovirus (como el VIH-1 , el VIH-2 , el virus de inmunodeficiencia de simios , etc.) y luego integrado en el genoma del huésped, donde crea un provirus . [2]
El término ADNc también se utiliza, normalmente en un contexto bioinformático , para referirse a la secuencia de transcripción de un ARNm, expresada como bases de ADN (desoxi-GCAT) en lugar de bases de ARN (GCAU).
La patentabilidad del ADNc fue objeto de una decisión de la Corte Suprema de los Estados Unidos en 2013 en el caso Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, Inc. Como compromiso, la Corte declaró que el ADNc compuesto únicamente por exones es patentable, mientras que las secuencias aisladas de ADN natural que comprenden intrones no lo son.
El ARN sirve como plantilla para la síntesis de ADNc. [3] En la vida celular, el ADNc es generado por virus y retrotransposones para la integración del ARN en el ADN genómico objetivo . En biología molecular, el ARN se purifica a partir del material de origen después de que se eliminan el ADN genómico, las proteínas y otros componentes celulares. Luego, el ADNc se sintetiza mediante transcripción inversa in vitro . [4]
El ARN se transcribe a partir del ADN genómico en las células huésped y se extrae primero lisando las células y luego purificando el ARN utilizando métodos ampliamente utilizados, como fenol-cloroformo, columna de sílice y métodos de extracción de ARN basados en perlas. [5] Los métodos de extracción varían según el material de origen. Por ejemplo, la extracción de ARN del tejido vegetal requiere reactivos adicionales, como polivinilpirrolidona (PVP), para eliminar compuestos fenólicos, carbohidratos y otros compuestos que de otro modo inutilizarían el ARN. [6] Para eliminar el ADN y las proteínas, se utilizan enzimas como la ADNasa y la proteinasa K para la degradación. [7] Es importante destacar que la integridad del ARN se mantiene inactivando las ARNasas con agentes caotrópicos como el isotiocianato de guanidinio, el dodecil sulfato de sodio (SDS), el fenol o el cloroformo. Luego, el ARN total se separa de otros componentes celulares y se precipita con alcohol. Existen varios kits comerciales para extracciones de ARN simples y rápidas para aplicaciones específicas. [8] Se pueden utilizar métodos adicionales basados en perlas para aislar subtipos específicos de ARN (por ejemplo, ARNm y microARN ) en función del tamaño o de regiones de ARN únicas. [9] [10]
Utilizando una enzima transcriptasa inversa y plantillas de ARN purificadas, se produce una hebra de ADNc (síntesis de ADNc de primera hebra). La transcriptasa inversa M-MLV del virus de la leucemia murina de Moloney se utiliza comúnmente debido a su actividad reducida de ARNasa H adecuada para la transcripción de ARN más largos. [11] La transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar también se puede utilizar para plantillas de ARN con estructuras secundarias fuertes (es decir, alta temperatura de fusión). [12] El ADNc se genera comúnmente a partir del ARNm para análisis de expresión génica como RT-qPCR y RNA-seq . [13] El ARNm se transcribe de forma inversa selectiva utilizando cebadores oligo-d T que son el complemento inverso de la cola poliadenilada en el extremo 3' de todo el ARNm. El cebador oligo-dT se une a la cola poliadenilada del ARNm para servir como un sitio de unión para que la transcriptasa inversa comience la transcripción inversa. Una mezcla optimizada de oligo-dT y cebadores hexaméricos aleatorios aumenta la posibilidad de obtener ADNc de longitud completa al tiempo que reduce el sesgo 5' o 3'. [14] El ARN ribosómico también se puede agotar para enriquecer tanto el ARNm como las transcripciones no poliadeniladas, como algunos ARN no codificantes . [15]
El resultado de las síntesis de primera cadena, los híbridos ARN-ADN, se puede procesar a través de múltiples métodos de síntesis de segunda cadena o procesarse directamente en ensayos posteriores. [16] [17] Un método temprano conocido como síntesis cebada con horquilla se basó en la formación de horquilla en el extremo 3' del ADNc de primera cadena para cebar la síntesis de segunda cadena. Sin embargo, la preparación es aleatoria y la hidrólisis de la horquilla conduce a la pérdida de información. El procedimiento de Gubler y Hoffman utiliza la ARNasa H de E. Coli para cortar el ARNm que se reemplaza con la ADN polimerasa I de E. Coli y se sella con la ADN ligasa de E. Coli . Una optimización de este procedimiento se basa en la baja actividad de la ARNasa H de M-MLV para cortar el ARNm y luego eliminar el ARN restante agregando la ARNasa H después de la traducción de la ADN polimerasa del ADNc de segunda cadena. Esto evita la pérdida de información de secuencia en el extremo 5' del ARNm.
El ADN complementario se utiliza a menudo en la clonación de genes o como sondas genéticas o en la creación de una biblioteca de ADNc . Cuando los científicos transfieren un gen de una célula a otra para expresar el nuevo material genético como una proteína en la célula receptora, el ADNc se añadirá a la receptora (en lugar del gen completo), porque el ADN de un gen completo puede incluir ADN que no codifica la proteína o que interrumpe la secuencia codificante de la proteína (por ejemplo, intrones ). Las secuencias parciales de ADNc se obtienen a menudo como etiquetas de secuencia expresada .
Ahora que la amplificación de secuencias de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es algo habitual, normalmente se realiza una transcripción inversa como paso inicial, seguida de una PCR para obtener una secuencia exacta de ADNc para la expresión intracelular. Esto se consigue diseñando cebadores de ADN específicos de la secuencia que se hibridan con los extremos 5' y 3' de una región de ADNc que codifica una proteína. Una vez amplificada, la secuencia se puede cortar en cada extremo con nucleasas e insertar en una de las muchas secuencias de ADN circulares pequeñas conocidas como vectores de expresión. Estos vectores permiten la autorreplicación, dentro de las células, y potencialmente la integración en el ADN del huésped. Normalmente también contienen un promotor fuerte para impulsar la transcripción del ADNc objetivo en ARNm, que luego se traduce en proteína.
El ADNc también se utiliza para estudiar la expresión génica a través de métodos como RNA-seq o RT-qPCR . [18] [19] [20] Para la secuenciación, el ARN debe fragmentarse debido a las limitaciones de tamaño de la plataforma de secuenciación. Además, el ADNc sintetizado de segunda cadena debe ligarse con adaptadores que permitan que los fragmentos de ADNc se amplifiquen por PCR y se unan a las celdas de flujo de secuenciación. Los métodos de análisis específicos de genes utilizan comúnmente microarrays y RT-qPCR para cuantificar los niveles de ADNc mediante métodos fluorométricos y otros.
El 13 de junio de 2013, la Corte Suprema de los Estados Unidos dictaminó en el caso de Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics que, si bien los genes naturales no se pueden patentar , el ADNc es patentable porque no se produce de forma natural. [21]
Algunos virus también utilizan ADNc para convertir su ARN viral en ARNm (ARN viral → ADNc → ARNm). El ARNm se utiliza para fabricar proteínas virales que se apoderen de la célula huésped.
Un ejemplo de este primer paso del ARN viral al ADNc se puede ver en el ciclo de infección del VIH. En este caso, la membrana de la célula huésped se adhiere a la envoltura lipídica del virus, lo que permite que la cápside viral con dos copias del ARN genómico viral entre en el huésped. La copia del ADNc se realiza a través de la transcripción inversa del ARN viral, un proceso facilitado por la chaperona CypA y una transcriptasa inversa asociada a la cápside viral. [22]
El ADNc también se genera mediante retrotransposones en los genomas eucariotas. Los retrotransposones son elementos genéticos móviles que se desplazan dentro de los genomas y, a veces, entre ellos, a través de intermediarios de ARN. Este mecanismo es compartido con los virus, con la exclusión de la generación de partículas infecciosas. [23] [24]
Mark D. Adams et al. "Secuenciación complementaria de ADN: etiquetas de secuencias expresadas y Proyecto Genoma Humano". Science (Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia) 252.5013 (1991): 1651–1656. Web.
Philip M. Murphy y H. Lee Tiffany. "Clonación de ADN complementario que codifica un receptor funcional de interleucina-8 humana". Science (Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia) 253.5025 (1991): 1280–1283. Web.