La recombinación específica de sitio , también conocida como recombinación específica de sitio conservadora , es un tipo de recombinación genética en la que tiene lugar el intercambio de cadenas de ADN entre segmentos que poseen al menos un cierto grado de homología de secuencia . [1] [2] [3] Las enzimas conocidas como recombinasas de sitio específico (SSR) realizan reordenamientos de segmentos de ADN reconociendo y uniéndose a secuencias (sitios) de ADN cortas y específicas, en las que escinden la columna vertebral del ADN e intercambian los dos ADN. hélices implicadas y volver a unir las hebras de ADN. En algunos casos, la presencia de una enzima recombinasa y los sitios de recombinación es suficiente para que se desarrolle la reacción; en otros sistemas se requieren varias proteínas accesorias y/o sitios accesorios. Muchas estrategias diferentes de modificación del genoma , entre ellas el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE), un enfoque avanzado para la introducción dirigida de unidades de transcripción en loci genómicos predeterminados, se basan en SSR.
Los sistemas de recombinación de sitio específico son muy específicos, rápidos y eficientes, incluso cuando se enfrentan a genomas eucarióticos complejos . [4] Se emplean de forma natural en una variedad de procesos celulares, incluida la replicación , diferenciación y patogénesis del genoma bacteriano , y el movimiento de elementos genéticos móviles . [5] Por las mismas razones, presentan una base potencial para el desarrollo de herramientas de ingeniería genética . [6]
Los sitios de recombinación suelen tener entre 30 y 200 nucleótidos de longitud y constan de dos motivos con una simetría de repetición invertida parcial, a los que se une la recombinasa y que flanquean una secuencia cruzada central en la que tiene lugar la recombinación. Los pares de sitios entre los que se produce la recombinación suelen ser idénticos, pero existen excepciones (por ejemplo, attP y attB de λ integrasa ). [7]
Según las homologías de secuencia de aminoácidos y la relación mecanística, la mayoría de las recombinasas específicas de sitio se agrupan en una de dos familias: la familia de la tirosina (Tyr) recombinasa o la familia de la serina (Ser) recombinasa . Los nombres provienen del residuo de aminoácido nucleofílico conservado presente en cada clase de recombinasa que se utiliza para atacar el ADN y que se une covalentemente a él durante el intercambio de cadenas. Los primeros miembros identificados de la familia de las serina recombinasas se conocían como resolvasas o ADN invertasas, mientras que el miembro fundador de las tirosina recombinasas, la integrasa del fago lambda (que utiliza sitios de reconocimiento attP/B), difiere de las ahora bien conocidas enzimas como Cre ( del fago P1 ) y FLP (de la levadura Saccharomyces cerevisiae ). Las serina recombinasas famosas incluyen enzimas como la gamma-delta resolvasa (del transposón Tn 1000 ), la resolvasa Tn3 (del transposón Tn3) y la integrasa φ C31 (del fago φ C31). [8]
Aunque los miembros individuales de las dos familias de recombinasas pueden realizar reacciones con los mismos resultados prácticos, las familias no están relacionadas entre sí y tienen diferentes estructuras proteicas y mecanismos de reacción. A diferencia de las tirosina recombinasas, las serina recombinasas son altamente modulares, como lo indicaron primero los estudios bioquímicos [9] y luego lo demostraron las estructuras cristalográficas. [10] [11] El conocimiento de estas estructuras proteicas podría resultar útil al intentar rediseñar las proteínas recombinasas como herramientas para la manipulación genética.
La recombinación entre dos sitios de ADN comienza con el reconocimiento y la unión de estos sitios (un sitio en cada una de dos moléculas de ADN de doble cadena separadas, o al menos dos segmentos distantes de la misma molécula) por la enzima recombinasa. A esto le sigue la sinapsis , es decir, la unión de los sitios para formar el complejo sináptico. Es dentro de este complejo sináptico donde tiene lugar el intercambio de cadenas, a medida que el ADN se escinde y se vuelve a unir mediante reacciones de transesterificación controladas . Durante el intercambio de cadenas, cada molécula de ADN de doble cadena se corta en un punto fijo dentro de la región de cruce del sitio de reconocimiento, liberando un grupo hidroxilo desoxirribosa , mientras que la enzima recombinasa forma un enlace covalente transitorio con un fosfato de la cadena principal del ADN . Este enlace fosfodiéster entre el grupo hidroxilo del residuo nucleofílico de serina o tirosina conserva la energía que se gastó en la escisión del ADN. La energía almacenada en este enlace se utiliza posteriormente para volver a unir el ADN al grupo hidroxilo de desoxirribosa correspondiente en la otra molécula de ADN. Por tanto, toda la reacción se desarrolla sin necesidad de cofactores externos ricos en energía como el ATP .
Aunque la reacción química básica es la misma para las tirosina y las serina recombinasas, existen algunas diferencias entre ellas. [12] Las tirosina recombinasas, como Cre o FLP , escinden una cadena de ADN a la vez en puntos escalonados de 6 a 8 pb, uniendo el extremo 3' de la cadena al grupo hidroxilo del nucleófilo de tirosina (Fig. 1). . [13] El intercambio de hebras luego se realiza a través de una hebra intermedia cruzada análoga a la unión Holliday en la que solo se ha intercambiado un par de hebras. [14] [15]
El mecanismo y el control de las serina recombinasas se conocen mucho menos. Este grupo de enzimas no se descubrió hasta mediados de la década de 1990 y todavía es relativamente pequeño. Los miembros ahora clásicos gamma-delta y Tn3 resolvasa , pero también nuevas incorporaciones como las integrasas φC31-, Bxb1- y R4, cortan las cuatro cadenas de ADN simultáneamente en puntos escalonados en 2 pb (Fig. 2). [16] Durante la escisión, se forma un enlace proteína-ADN mediante una reacción de transesterificación , en la que un enlace fosfodiéster se reemplaza por un enlace fosfoserina entre un fosfato 5' en el sitio de escisión y el grupo hidroxilo del residuo de serina conservado (S10 en resolver). [17] [18]
Todavía no está del todo claro cómo se produce el intercambio de cadenas después de la escisión del ADN. Sin embargo, se ha demostrado que las hebras se intercambian mientras están unidas covalentemente a la proteína, con una rotación neta resultante de 180°. [19] [20] El modelo más citado (pero no el único) que explica estos hechos es el "modelo de rotación de subunidades" (Fig. 2). [12] [21] Independientemente del modelo, los dúplex de ADN están situados fuera del complejo proteico y se necesita un gran movimiento de la proteína para lograr el intercambio de cadenas. En este caso, los sitios de recombinación son ligeramente asimétricos, lo que permite a la enzima distinguir los extremos izquierdo y derecho del sitio. Al generar productos, los extremos izquierdos siempre se unen a los extremos derechos de sus sitios asociados y viceversa. Esto hace que se reconstituyan diferentes sitios híbridos de recombinación en los productos de recombinación. Se evita la unión de los extremos izquierdo a izquierda o de derecha a derecha debido a la secuencia de "superposición" asimétrica entre los puntos escalonados de intercambio de las hebras superior e inferior, que contrasta marcadamente con el mecanismo empleado por las tirosina recombinasas. [12]
La reacción catalizada por la Cre-recombinasa, por ejemplo, puede conducir a la escisión del segmento de ADN flanqueado por los dos sitios (Fig. 3A), pero también puede conducir a la integración o inversión de la orientación del segmento de ADN flanqueado (Fig. 3B). ). El resultado de la reacción está dictado principalmente por las ubicaciones y orientaciones relativas de los sitios que se van a recombinar, pero también por la especificidad innata del sistema específico del sitio en cuestión. Las escisiones y las inversiones ocurren si la recombinación tiene lugar entre dos sitios que se encuentran en la misma molécula (recombinación intramolecular), y si los sitios están en la misma (repetición directa) o en orientación opuesta (repetición invertida), respectivamente. Por el contrario, las inserciones se producen si la recombinación se produce en sitios que se encuentran en dos moléculas de ADN diferentes (recombinación intermolecular), siempre que al menos una de estas moléculas sea circular. La mayoría de los sistemas de sitio específico están altamente especializados, catalizan sólo uno de estos diferentes tipos de reacción y han evolucionado para ignorar los sitios que están en la orientación "incorrecta".