En bioquímica , la inmunotinción es cualquier uso de un método basado en anticuerpos para detectar una proteína específica en una muestra. El término "inmunotinción" se utilizó originalmente para referirse a la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido, como lo describió por primera vez Albert Coons en 1941. [1] Sin embargo, la inmunotinción ahora abarca una amplia gama de técnicas utilizadas en histología , biología celular y biología molecular que utilizan métodos de tinción basados en anticuerpos.
La tinción inmunohistoquímica o IHC de secciones de tejido (o inmunocitoquímica , que es la tinción de células ), es quizás la técnica de inmunotinción más comúnmente aplicada. [2] Si bien los primeros casos de tinción IHC usaban colorantes fluorescentes (ver inmunofluorescencia ), ahora se usan otros métodos no fluorescentes que usan enzimas como la peroxidasa (ver tinción inmunoperoxidasa ) y la fosfatasa alcalina . Estas enzimas son capaces de catalizar reacciones que dan un producto coloreado que es fácilmente detectable por microscopía óptica . Alternativamente, se pueden usar elementos radiactivos como marcadores y la inmunorreacción se puede visualizar por autorradiografía . [3]
La preparación o fijación de los tejidos es esencial para la conservación de la morfología y la arquitectura de las células. Una fijación inapropiada o prolongada puede reducir significativamente la capacidad de unión de los anticuerpos. Muchos antígenos se pueden demostrar con éxito en secciones de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina . Sin embargo, algunos antígenos no sobrevivirán ni siquiera a cantidades moderadas de fijación con aldehído. En estas condiciones, los tejidos se deben congelar rápidamente en fresco en nitrógeno líquido y cortar con un criostato. Las desventajas de las secciones congeladas incluyen una morfología deficiente, una resolución deficiente a mayores aumentos, dificultad para cortar sobre secciones de parafina y la necesidad de almacenamiento congelado. Alternativamente, las secciones vibratomo no requieren que el tejido se procese a través de solventes orgánicos o calor alto, que pueden destruir la antigenicidad, o se alteren por congelación y descongelación. La desventaja de las secciones vibratomo es que el proceso de seccionamiento es lento y difícil con tejidos blandos y mal fijados, y que las marcas de vibración o las líneas vibratomo suelen ser evidentes en las secciones. [ cita requerida ]
La detección de muchos antígenos se puede mejorar drásticamente con métodos de recuperación de antígenos que actúan rompiendo algunos de los enlaces cruzados de proteínas formados por fijación para descubrir sitios antigénicos ocultos. Esto se puede lograr calentando durante períodos de tiempo variables (recuperación de epítopos inducida por calor o HIER) o utilizando digestión enzimática (recuperación de epítopos inducida por proteólisis o PIER). [4]
Una de las principales dificultades de la tinción IHC es la de superar el fondo específico o no específico. La optimización de los métodos y tiempos de fijación, el pretratamiento con agentes bloqueantes, la incubación de anticuerpos con alto contenido de sal y la optimización de los tampones y tiempos de lavado posteriores al lavado de anticuerpos son importantes para obtener una inmunotinción de alta calidad. Además, la presencia de controles positivos y negativos para la tinción es esencial para determinar la especificidad. [ cita requerida ]
Se puede utilizar un citómetro de flujo para el análisis directo de células que expresan una o más proteínas específicas. Las células se inmunotiñen en solución utilizando métodos similares a los utilizados para la inmunofluorescencia y luego se analizan mediante citometría de flujo. [ cita requerida ]
La citometría de flujo tiene varias ventajas sobre la inmunohistoquímica, entre ellas: la capacidad de definir poblaciones celulares distintas por su tamaño y granularidad; la capacidad de excluir células muertas; una sensibilidad mejorada; y un análisis multicolor para medir varios antígenos simultáneamente. Sin embargo, la citometría de flujo puede ser menos eficaz para detectar poblaciones celulares extremadamente raras, y hay una pérdida de relaciones arquitectónicas en ausencia de una sección de tejido. [5] La citometría de flujo también tiene un alto costo de capital asociado con la compra de un citómetro de flujo. [ cita requerida ]
La técnica Western blot permite detectar proteínas específicas a partir de extractos de células o tejidos, antes o después de cualquier paso de purificación . Las proteínas generalmente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel antes de transferirlas a una membrana sintética mediante métodos de transferencia en seco, semiseco o húmedo. Luego, la membrana se puede sondear utilizando anticuerpos utilizando métodos similares a la inmunohistoquímica, pero sin necesidad de fijación. La detección se realiza típicamente utilizando anticuerpos ligados a peroxidasa para catalizar una reacción quimioluminiscente . [ cita requerida ]
El Western blot es un método de biología molecular de rutina que se puede utilizar para comparar de forma semicuantitativa los niveles de proteínas entre extractos. La separación por tamaño antes del blot permite medir el peso molecular de la proteína en comparación con marcadores de peso molecular conocidos. [ cita requerida ]
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA es un método de diagnóstico para determinar cuantitativa o semicuantitativa las concentraciones de proteínas del plasma sanguíneo , suero o extractos de células/tejidos en un formato de placa de múltiples pocillos (generalmente 96 pocillos por placa). En términos generales, las proteínas en solución se absorben en las placas ELISA. Los anticuerpos específicos para la proteína de interés se utilizan para sondear la placa. El fondo se minimiza optimizando los métodos de bloqueo y lavado (como para la IHC), y la especificidad se asegura mediante la presencia de controles positivos y negativos. Los métodos de detección generalmente se basan en colorimetría o quimioluminiscencia. [ cita requerida ]
La microscopía electrónica o EM se puede utilizar para estudiar la microarquitectura detallada de tejidos o células. La inmuno-EM permite la detección de proteínas específicas en secciones de tejido ultradelgadas. Los anticuerpos marcados con partículas de metales pesados (por ejemplo, oro) se pueden visualizar directamente utilizando la microscopía electrónica de transmisión . Si bien es potente para detectar la localización subcelular de una proteína, la inmuno-EM puede ser técnicamente desafiante, costosa y requerir una optimización rigurosa de los métodos de fijación y procesamiento de tejidos. La biotinilación de proteínas in vivo se propuso para aliviar los problemas causados por la incompatibilidad frecuente de la tinción de anticuerpos con protocolos de fijación que preservan mejor la morfología celular. [6]
En los métodos de inmunotinción, se utiliza un anticuerpo para detectar un epítopo proteico específico . Estos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales . La detección de este primer anticuerpo o anticuerpo primario se puede lograr de múltiples maneras.
Como se ha descrito anteriormente, las enzimas como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina se utilizan habitualmente para catalizar reacciones que dan lugar a un producto coloreado o quimioluminiscente . Las moléculas fluorescentes se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia o microscopía confocal . [ cita requerida ]
Las aplicaciones de la inmunotinción son numerosas, pero las más habituales son en el diagnóstico clínico y la investigación de laboratorio . [ cita requerida ]
Clínicamente, la IHC se utiliza en histopatología para el diagnóstico de tipos específicos de cáncer basándose en marcadores moleculares. [ cita requerida ]
En la ciencia de laboratorio, la inmunotinción se puede utilizar para una variedad de aplicaciones basadas en la investigación de la presencia o ausencia de una proteína, su distribución tisular, su localización subcelular y de cambios en la expresión o degradación de proteínas.