La terminación intrínseca , o independiente de rho , es un proceso que señala el final de la transcripción y libera la molécula de ARN recién construida . En bacterias como E. coli , la transcripción finaliza mediante un proceso dependiente de rho o un proceso independiente de rho. En el proceso dependiente de Rho, la proteína rho localiza y se une a la secuencia señal en el ARNm y envía señales para la escisión. Por el contrario, la terminación intrínseca no requiere una proteína especial para indicar la terminación y está controlada por secuencias específicas de ARN. Cuando comienza el proceso de terminación, el ARNm transcrito forma una estructura secundaria estable en forma de horquilla, también conocida como tallo-loop . Esta horquilla de ARN va seguida de múltiples nucleótidos de uracilo. Los enlaces entre uracilo (rU) y adenina (dA) son muy débiles. Una proteína unida a la ARN polimerasa (nusA) se une a la estructura de tallo-bucle con suficiente fuerza como para provocar que la polimerasa se detenga temporalmente. Esta pausa de la polimerasa coincide con la transcripción de la secuencia de poliuracilo. Los débiles enlaces adenina-uracilo reducen la energía de desestabilización del dúplex ARN-ADN, lo que le permite desenrollarse y disociarse de la ARN polimerasa. En general, la estructura del ARN modificada es lo que finaliza la transcripción.
Las estructuras de bucle de tallo que no van seguidas de una secuencia de poliuracilo hacen que la ARN polimerasa se detenga, pero normalmente continuará la transcripción después de un breve tiempo porque el dúplex es demasiado estable para desenrollarse lo suficiente como para provocar la terminación.
La terminación de la transcripción independiente de Rho es un mecanismo frecuente que subyace a la actividad de los elementos reguladores del ARN que actúan en cis , como los riboswitches .
La función de propósito de la terminación intrínseca es señalar la disociación del complejo de elongación ternario (TEC) , poniendo fin a la transcripción. Terminación intrínseca independiente de la proteína Rho , a diferencia de la terminación Rho dependiente, donde la proteína Rho bacteriana entra y actúa sobre la ARN polimerasa, provocando que se disocia. [1] Aquí, no hay proteína adicional y la transcripción forma su propia estructura de bucle. Por lo tanto, la terminación intrínseca también regula el nivel de transcripción, determinando cuántas polimerasas pueden transcribir un gen durante un período de tiempo determinado y puede ayudar a prevenir interacciones con los cromosomas vecinos. [1]
El proceso en sí está regulado a través de factores de terminación tanto positivos como negativos, generalmente mediante la modificación de la estructura en horquilla. Esto se logra mediante interacciones con ARN monocatenario que corresponde al área aguas arriba del bucle, lo que resulta en la interrupción del proceso de terminación. Además, existe cierta implicación de que el sitio de la nuez también puede contribuir a la regulación, ya que participa en el reclutamiento de algunos componentes críticos en la formación de la horquilla. [2]
En la terminación intrínseca, el transcrito de ARN se duplica y las bases se emparejan consigo mismo, creando una estructura de bucle o tallo de ARN. Esta estructura es crítica para la liberación tanto de la transcripción como de la polimerasa al final de la transcripción. [3] En las células vivas, los componentes clave son el propio bucle estable, así como la secuencia de 6 a 8 residuos de uracilo que le siguen. [3] El tallo generalmente consta de 8-9 pares de bases, principalmente guanina y citosina (GC), y el bucle consta de 4-8 residuos. Se cree que la porción del tallo de la estructura es esencial para la terminación de la transcripción, mientras que el bucle no lo es. [4] Esto se sugiere por el hecho de que la terminación se puede lograr en estructuras no nativas que no incluyen el bucle. [5]
La porción del tallo de la horquilla suele ser rica en pares de bases GC. Los pares de bases de GC tienen importantes interacciones de apilamiento de bases y pueden formar tres enlaces de hidrógeno entre sí, lo que los hace muy termodinámicamente favorables. Por el contrario, si bien la secuencia rica en uracilo que sigue a la horquilla no siempre es necesaria para la terminación, [6] se plantea la hipótesis de que la secuencia rica en uracilo ayuda en la terminación intrínseca porque el enlace UA no es tan fuerte como los enlaces GC. [4] Esta inestabilidad inherente actúa para favorecer cinéticamente la disociación del transcrito de ARN. [4]
Para determinar la longitud óptima del tallo, los investigadores modificaron su longitud y observaron la rapidez con la que se producía la terminación. [3] Cuando la longitud del tallo se alargó o acortó desde la longitud estándar de 8-9 pares de bases, la terminación fue menos eficiente y, si los cambios fueron lo suficientemente grandes, la terminación cesó por completo. [3]
Los experimentos determinaron que si está presente una secuencia de oligonucleótidos idéntica a la porción aguas abajo del tallo, se emparejará con la porción aguas arriba. [5] Esto crea una estructura que es análoga a la estructura nativa de vástago-bucle, pero le falta el bucle al final. Sin la presencia del bucle, aún es posible que se produzca la terminación intrínseca. [5] Esto indica que el bucle no es inherentemente necesario para la terminación intrínseca. [ cita necesaria ]
Generalmente, la ausencia de la secuencia rica en uracilo que sigue al bucle madre dará como resultado un retraso o una pausa en la transcripción, pero la terminación no cesará por completo. [6]
La terminación intrínseca está impulsada por señales codificadas directamente en el ADN y el ARN. La señal aparece como una horquilla y es seguida por 8 uridinas en el extremo 3'. Esto conduce a una rápida disociación del complejo de elongación. Hairpin inactiva y desestabiliza el TEC al debilitar las interacciones en el sitio de unión de ARN-ADN y otros sitios que mantienen unido este complejo. La pausa inducida por el estiramiento de los uracilos es importante y proporciona tiempo para la formación de horquillas. En ausencia de tracto U, la formación de horquillas no da como resultado una terminación eficiente, lo que indica su importancia en este proceso. [7]
El proceso de desestabilización por elongación se produce en cuatro pasos [7]
En cuanto a los inhibidores de la terminación intrínseca, aún se desconoce mucho. Uno de los pocos ejemplos que se conoce es la proteína 7 del bacteriófago. Está formada por estructuras crio-EM 3.4A y 4.0A de P7-NusA-TEC y P7-TEC. [8] Esta proteína bacteriófaga 7 detiene la terminación de la transcripción bloqueando el canal de salida de ARN de la ARN polimerasa (RNAP) e impidiendo la formación de horquillas de ARN en el terminador intrínseco. Además, la proteína 7 del bacteriófago inhibe los movimientos de sujeción de RNAP. [8] Acortar la media hélice C-terminal de la RNAP disminuye ligeramente la actividad inhibidora. Estos movimientos de sujeción de RNAP han sido atacados por algunos otros inhibidores de RNAP bacteriano. Estos inhibidores incluyen mixopironina , corallopironina y ripostatina. Estos funcionan inhibiendo la isomerización. [8]
Las ARN polimerasas en los tres dominios de la vida tienen alguna versión de terminación independiente del factor. Todos ellos utilizan tractos de poliuracilo, aunque los mecanismos exactos y las secuencias accesorias varían. En arqueas y eucariotas, parece que no se requiere una horquilla. [9]
La transcripción arqueal comparte vínculos eucariotas y bacterianos. Con los eucariotas, comparte similitudes con sus factores de iniciación que ayudan a la transcripción a identificar secuencias apropiadas, como los homólogos de la caja TATA , así como factores que mantienen el alargamiento de la transcripción. Sin embargo, se necesitan factores de transcripción adicionales similares a los que se encuentran en las bacterias para que se produzca todo el proceso. [9]
En términos de terminación de la transcripción, el genoma de las arqueas es único porque es sensible tanto a la terminación intrínseca como a la terminación dependiente de factores. El análisis bioinformático ha demostrado que aproximadamente la mitad de los genes y operones de Archaea se organizan en señales o contienen señales para la terminación intrínseca. [10] La ARN polimerasa de Archaeal responde a señales intrínsecas tanto in vivo como in vitro , como las regiones ricas en poli-U. Sin embargo, a diferencia de la terminación intrínseca bacteriana, no se necesita ninguna estructura de ARN específica ni horquilla. El entorno circundante y otros factores del genoma aún pueden influir en la terminación. [10]
La terminación dependiente de factor en arqueas también es distinta de la terminación dependiente de factor en bacterias. [9] El factor de terminación aCASP1 (también conocido como FttA) reconoce regiones ricas en poli-U, probablemente cooperando con el modo "intrínseco" para lograr una terminación más eficiente. [11]
La ARN polimerasa III realiza una terminación "de tipo intrínseco". La mayoría de los genes transcritos por RNAP III tienen una región poli(dT). Sin embargo, aunque la poli(dT) detiene todas las ARN polimerasas, por sí sola no puede ser insuficiente; algún otro mecanismo debe desestabilizar la abrazadera. En RNAP III, algunos sitios poli(dT) son de hecho de lectura completa ocasionalmente: algunos genes tienen múltiples regiones de este tipo, lo que permite que se produzcan transcripciones de diferentes longitudes. [12]
La inestabilidad de los híbridos rU:dA probablemente sea esencial para la terminación mediante RNAP III. Partes de las subunidades centrales C1 y C2, así como los "subcomplejos" C53/37 y C11 son funcionalmente importantes. Varios factores extraños pueden modificar el comportamiento de terminación. [12]