La secuenciación de Maxam-Gilbert es un método de secuenciación de ADN desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert en 1976-1977. Este método se basa en la modificación química parcial del ADN específica de la nucleobase y la posterior escisión de la cadena principal del ADN en sitios adyacentes a los nucleótidos modificados . [1]
La secuenciación Maxam-Gilbert fue el primer método ampliamente adoptado para la secuenciación de ADN y, junto con el método didesoxi de Sanger , representa la primera generación de métodos de secuenciación de ADN. La secuenciación Maxam-Gilbert ya no se utiliza ampliamente, ya que ha sido reemplazada por métodos de secuenciación de próxima generación .
Aunque Maxam y Gilbert publicaron su método de secuenciación química dos años después de que Frederick Sanger y Alan Coulson publicaran su trabajo sobre la secuenciación plus-minus, [2] [3] la secuenciación Maxam-Gilbert se hizo rápidamente más popular, ya que el ADN purificado se podía utilizar directamente, mientras que el método Sanger inicial requería que cada inicio de lectura se clonara para la producción de ADN monocatenario. Sin embargo, con la mejora del método de terminación de cadena (ver más abajo), la secuenciación Maxam-Gilbert ha caído en desgracia debido a su complejidad técnica que prohíbe su uso en kits de biología molecular estándar, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y las dificultades con la ampliación. [4]
El artículo de 1977 de Allan Maxam y Walter Gilbert “Un nuevo método para secuenciar ADN” fue distinguido con el premio Citation for Chemical Breakthrough Award de la División de Historia de la Química de la Sociedad Química Estadounidense en 2017. Fue entregado al Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de Harvard. [5]
La secuenciación Maxam–Gilbert requiere un marcaje radiactivo en un extremo 5′ del fragmento de ADN que se va a secuenciar (normalmente mediante una reacción de quinasa utilizando gamma- 32 P ATP ) y la purificación del ADN. El tratamiento químico genera roturas en una pequeña proporción de una o dos de las cuatro bases de nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Por ejemplo, las purinas (A+G) se despurinan utilizando ácido fórmico , las guaninas (y en cierta medida las adeninas ) se metilan con sulfato de dimetilo y las pirimidinas (C+T) se hidrolizan utilizando hidrazina . La adición de sal ( cloruro de sodio ) a la reacción de hidrazina inhibe la reacción de timina para la reacción de solo C. Los ADN modificados pueden escindirse entonces con piperidina caliente ; (CH 2 ) 5 NH en la posición de la base modificada. La concentración de los productos químicos modificadores se controla para introducir, en promedio, una modificación por molécula de ADN. De este modo, se genera una serie de fragmentos marcados, desde el extremo radiomarcado hasta el primer sitio de "corte" en cada molécula.
Los fragmentos de las cuatro reacciones se someten a electroforesis uno al lado del otro en geles de acrilamida desnaturalizantes para separarlos por tamaño. Para visualizar los fragmentos, el gel se expone a una película de rayos X para realizar una autorradiografía , lo que produce una serie de bandas oscuras que muestran la ubicación de moléculas de ADN radiomarcadas idénticas. A partir de la presencia y ausencia de ciertos fragmentos, se puede inferir la secuencia. [1] [6]
Este método condujo al ensayo de interferencia de metilación, utilizado para mapear los sitios de unión al ADN para las proteínas que se unen al ADN . [7]
En 1994 se desarrolló un protocolo de secuenciación automatizada Maxam-Gilbert. [8]
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