La puromicina es un antibiótico inhibidor de la síntesis de proteínas que provoca la terminación prematura de la cadena durante la traducción .
La puromicina es un antibiótico aminonucleósido , derivado de la bacteria Streptomyces alboniger , [1] que causa la terminación prematura de la cadena durante la traducción que tiene lugar en el ribosoma . Parte de la molécula se asemeja al extremo 3' del ARNt aminoacilado . Entra en el sitio A y se transfiere a la cadena en crecimiento, lo que provoca la formación de una cadena naciente puromicilada y la liberación prematura de la cadena. [2] El mecanismo de acción exacto se desconoce en este momento, pero la posición 3' contiene un enlace amida en lugar del enlace éster normal del ARNt . Eso hace que la molécula sea mucho más resistente a la hidrólisis y detiene el ribosoma .
La puromicina es selectiva tanto para procariotas como para eucariotas .
También cabe destacar que la puromicina es fundamental en la expresión del ARNm . En esta reacción, una molécula de puromicina se une químicamente al extremo de una plantilla de ARNm , que luego se traduce en proteína. La puromicina puede entonces formar un enlace covalente con la cadena peptídica en crecimiento, lo que permite que el ARNm se una físicamente a su producto de traducción.
Los anticuerpos que reconocen cadenas nacientes puromiciladas también se pueden utilizar para purificar polipéptidos recién sintetizados [3] y para visualizar la distribución de ribosomas que traducen activamente mediante inmunofluorescencia . [4]
La puromicina es un inhibidor reversible de la dipeptidil-peptidasa II ( serina peptidasa ) y de la alanil aminopeptidasa del citosol ( metalolopeptidasa ). [5] [6] El mecanismo de inhibición no se entiende bien, sin embargo, la puromicina se puede utilizar para distinguir entre la aminopeptidasa M (activa) y la alanil aminopeptidasa del citosol (inhibida por la puromicina).
La puromicina se utiliza en biología celular como agente selectivo en sistemas de cultivo celular. Es tóxica para las células procariotas y eucariotas. La resistencia a la puromicina es conferida por el gen pac que codifica una puromicina N -acetil-transferasa (PAC) que se encontró en una cepa productora de Streptomyces. La puromicina es soluble en agua (50 mg/ml) como solución incolora a 10 mg/ml. La puromicina es estable durante un año como solución cuando se almacena a -20 °C. La dosis recomendada como agente de selección en cultivos celulares está dentro de un rango de 1-10 μg/ml, aunque puede ser tóxica para las células eucariotas en concentraciones tan bajas como 1 μg/ml. La puromicina actúa rápidamente y puede matar más del 99% de las células no resistentes en un día. [ cita requerida ]
La puromicina es poco activa en E. coli . Los transformantes resistentes a la puromicina se seleccionan en un medio de agar LB suplementado con 125 μg/mL de puromicina. Pero el uso de puromicina para la selección de E. coli requiere un ajuste preciso del pH y también depende de la cepa seleccionada. Para una selección sin problemas y resultados óptimos, es posible utilizar puromicina especialmente modificada. Las placas que contienen puromicina son estables durante 1 mes cuando se almacenan a 4 [7] °C. [ cita requerida ]
La resistencia a la puromicina en levaduras también puede ser conferida a través de la expresión del gen de la N-acetiltransferasa de puromicina ( pac ). [8] Las concentraciones letales de puromicina son mucho más altas para las cepas de Saccharomyces cerevisiae que para las líneas celulares de mamíferos. La eliminación del gen que codifica la bomba de eflujo de múltiples fármacos Pdr5 sensibiliza a las células a la puromicina. [ cita requerida ]
La plasticidad sináptica a largo plazo , como la que se requiere para los procesos de memoria , requiere cambios morfológicos a nivel proteico. Como la puromicina inhibe la síntesis proteica en las células eucariotas, los investigadores pudieron demostrar que las inyecciones de este fármaco provocarán pérdida de memoria tanto a corto como a largo plazo en ratones. [9]