La enzima peroxidasa de rábano picante ( HRP ), presente en las raíces del rábano picante , se utiliza ampliamente en aplicaciones bioquímicas . Es una metaloenzima con muchas isoformas, de las cuales la más estudiada es la C. Cataliza la oxidación de varios sustratos orgánicos por peróxido de hidrógeno.
La estructura de la enzima se resolvió por primera vez mediante cristalografía de rayos X en 1997 [2] y desde entonces se ha resuelto varias veces con varios sustratos. [3] Es una gran glicoproteína alfa-helicoidal que se une al hemo como cofactor redox .
Por sí sola, la enzima HRP, o sus conjugados, tienen poco valor; su presencia debe hacerse visible utilizando un sustrato que, cuando se oxida con HRP utilizando peróxido de hidrógeno como agente oxidante, produce un cambio de color característico que es detectable mediante métodos espectrofotométricos . [4] [5]
Se han descrito y comercializado numerosos sustratos para la peroxidasa de rábano picante con el fin de explotar las características deseables de la HRP. Estos sustratos se dividen en varias categorías distintas. La HRP cataliza la conversión de sustratos cromogénicos (p. ej., TMB , DAB , ABTS ) en productos coloreados y produce luz cuando actúa sobre sustratos quimioluminiscentes (p. ej., quimioluminiscencia mejorada por luminol ). [ cita requerida ]
La peroxidasa de rábano picante es una glicoproteína de 44.173,9 daltons con seis residuos de lisina que se puede conjugar con una molécula marcada. Produce un derivado coloreado, fluorimétrico [6] o luminiscente de la molécula marcada cuando se incuba con un sustrato adecuado, lo que permite detectarla y cuantificarla. La HRP se utiliza a menudo en conjugados (moléculas que se han unido genética o químicamente) para determinar la presencia de un objetivo molecular. Por ejemplo, un anticuerpo conjugado con HRP puede utilizarse para detectar una pequeña cantidad de una proteína específica en un western blot . Aquí, el anticuerpo proporciona la especificidad para localizar la proteína de interés, y la enzima HRP, en presencia de un sustrato, produce una señal detectable. [7] La peroxidasa de rábano picante también se utiliza habitualmente en técnicas como ELISA e inmunohistoquímica debido a su naturaleza monomérica y la facilidad con la que produce productos coloreados. La peroxidasa, una oxidorreductasa que contiene hemo, es una enzima comercialmente importante que cataliza la escisión reductora del peróxido de hidrógeno por un donante de electrones.
La peroxidasa de rábano picante es ideal en muchos aspectos para estas aplicaciones porque es más pequeña, más estable y menos costosa que otras alternativas populares como la fosfatasa alcalina . También tiene una alta tasa de recambio que permite la generación de señales fuertes en un lapso de tiempo relativamente corto. [8] Las altas concentraciones de fosfato disminuyen gravemente la estabilidad de la peroxidasa de rábano picante. Además de las aplicaciones biomédicas, la peroxidasa de rábano picante es una de las enzimas con importantes aplicaciones ambientales. Esta enzima es adecuada para la eliminación de compuestos aromáticos hidroxilados (HAC) que se consideran contaminantes primarios en una amplia variedad de aguas residuales industriales . [9]
Además, "en los últimos años, la técnica de marcar neuronas con la enzima peroxidasa de rábano picante se ha convertido en una herramienta importante. En su breve historia, este método probablemente ha sido utilizado por más neurobiólogos que la tinción de Golgi desde su descubrimiento en 1870". [10]
La peroxidasa de rábano picante cataliza la oxidación del luminol a 3-aminoftalato a través de varios intermediarios. La reacción va acompañada de la emisión de luz de baja intensidad a 428 nm. En presencia de ciertos productos químicos, la luz emitida se potencia hasta 1000 veces, lo que hace que la luz sea más fácil de detectar y aumenta la sensibilidad de la reacción. La mejora de la emisión de luz se denomina quimioluminiscencia potenciada (ECL). Se pueden utilizar varios potenciadores, como los fenoles modificados comúnmente conocidos (principalmente yodofenol). Varios sustratos en el mercado utilizan otros potenciadores que dan como resultado señales de luminiscencia hasta 13 veces mayores que los sustratos potenciados con fenol. [11] La intensidad de la luz es una medida del número de moléculas de enzima que reaccionan y, por lo tanto, de la cantidad de híbrido. La ECL es fácil de configurar y es sensible, detectando aproximadamente 0,5 pg de ácido nucleico en Southern blots y Northern blots . La detección por sustratos quimioluminiscentes tiene varias ventajas sobre los sustratos cromogénicos. La sensibilidad es de 10 a 100 veces mayor y es posible cuantificar la emisión de luz en un amplio rango dinámico, mientras que la de los precipitados coloreados es mucho más limitada, aproximadamente un orden de magnitud menor. La eliminación de los filtros es mucho más sencilla cuando se utilizan sustratos quimioluminiscentes. [ cita requerida ]
La peroxidasa de rábano picante se puede utilizar para varias reacciones de polimerización, pero la más estudiada es la polimerización de derivados de fenol. [12] Sin embargo, la peroxidasa de rábano picante también se puede utilizar como catalizador para reacciones de polimerización radical por transferencia de átomos [13] y crear polímeros en ausencia de peróxido de hidrógeno. En este caso, un sustrato para HRP es haluro de alquilo o nitrilo de alquilo, [14] que son iniciadores de reacciones ATRP. HRP reacciona con tales compuestos, creando radicales, que inician la polimerización. La ATRP catalizada por HRP proporciona un nivel de control sobre la polimerización comparable al obtenido en la reacción catalizada por metal.
Se han estudiado muchos materiales para imitar la HRP natural. Por ejemplo, se han utilizado nanopartículas de óxido de hierro y complejos que contienen hemina para imitar la HRP. [15] Estas enzimas artificiales similares a la HRP se han utilizado para muchas aplicaciones, que van desde la detección de biomarcadores y la inmunotinción tumoral hasta la lucha contra las incrustaciones biológicas.
