Un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total ( TIRFM ) es un tipo de microscopio con el que se puede observar una región delgada de una muestra, generalmente de menos de 200 nanómetros.
TIRFM es una modalidad de obtención de imágenes que utiliza la excitación de células fluorescentes en una sección de muestra óptica delgada que se apoya en un portaobjetos de vidrio. La técnica se basa en el principio de que cuando la luz de excitación se refleja totalmente internamente en un cubreobjetos sólido transparente en su interfaz con un medio líquido, se genera un campo electromagnético, también conocido como onda evanescente, en la interfaz sólido-líquido con el mismo. frecuencia como la luz de excitación. [1] La intensidad de la onda evanescente decae exponencialmente con la distancia desde la superficie del sólido, de modo que sólo las moléculas fluorescentes dentro de unos pocos cientos de nanómetros del sólido se excitan de manera eficiente. Luego se pueden obtener imágenes bidimensionales de la fluorescencia, aunque también existen mecanismos mediante los cuales se puede obtener información tridimensional sobre la localización de vesículas o estructuras en las células. [2]
La fluorescencia de campo amplio se introdujo en 1910, que era una técnica óptica que ilumina toda la muestra. [3] Luego se introdujo la microscopía confocal en 1960, que disminuyó el fondo y el tiempo de exposición de la muestra al dirigir la luz a un punto e iluminar conos de luz en la muestra. En la década de 1980, la introducción de TIRFM disminuyó aún más el fondo y el tiempo de exposición al iluminar solo la sección delgada de la muestra que se estaba examinando. [3]
Existen dos métodos comunes para producir la onda evanescente para TIRFM. [1] El primero es el método del prisma que utiliza un prisma para dirigir el láser hacia la interfaz entre el cubreobjetos y los medios/celdas en un ángulo incidente suficiente para causar una reflexión interna total. Esta configuración se ha aplicado a la microscopía celular durante más de 30 años, pero nunca se ha convertido en una herramienta convencional debido a varias limitaciones. Aunque existen muchas variaciones en la configuración del prisma, la mayoría restringe el acceso a la muestra, lo que dificulta realizar manipulaciones, inyectar medios en el espacio de la muestra o realizar mediciones fisiológicas. [2] Otra desventaja es que en la mayoría de las configuraciones basadas en diseños de microscopio invertido, la iluminación se introduce en el lado de la muestra opuesto a la óptica del objetivo, lo que requiere imágenes de la región del campo evanescente a través de la mayor parte de la muestra. Se requiere una gran complejidad y precisión para obtener imágenes de este sistema, lo que significó que muchos biólogos no utilizaron el método del prisma, sino que se limitó a su uso por parte de los físicos.
El otro método se conoce como método de la lente objetiva, que ha aumentado el uso de TIRFM en microscopía celular y ha aumentado aún más desde que estuvo disponible una solución comercial. [2] En este mecanismo, se puede cambiar fácilmente entre fluorescencia de campo amplio estándar y TIRF cambiando la posición fuera del eje del foco del haz en el plano focal posterior del objetivo. Hay varias formas desarrolladas de cambiar las posiciones del haz, como usar un actuador que puede cambiar la posición en relación con el iluminador de fluorescencia que está conectado al microscopio.
En biología celular y molecular , se han estudiado con microscopios de fluorescencia convencionales un gran número de eventos moleculares en las superficies celulares, como la adhesión celular , la unión de las células por hormonas , la secreción de neurotransmisores y la dinámica de las membranas . Sin embargo, los fluoróforos que están unidos a la superficie de la muestra y los del medio circundante existen en un estado de equilibrio . Cuando estas moléculas se excitan y se detectan con un microscopio de fluorescencia convencional, la fluorescencia resultante de los fluoróforos unidos a la superficie a menudo se ve abrumada por la fluorescencia de fondo debido a la población mucho mayor de moléculas no unidas. TIRFM permite la excitación selectiva de los fluoróforos unidos a la superficie, mientras que las moléculas no unidas no se excitan ni emiten fluorescencia. Debido a la selectividad de la superficie submicrónica, TIRFM se ha convertido en un método de elección para la detección de una sola molécula.
Existen muchas aplicaciones de TIRFM en microscopía celular. Algunas de estas aplicaciones incluyen:
Con la capacidad de resolver ópticamente vesículas individuales y seguir directamente la dinámica de sus interacciones, TIRFM proporciona la capacidad de estudiar la gran cantidad de proteínas involucradas en procesos neurobiológicos de una manera que antes no era posible. [2]
TIRFM proporciona varios beneficios sobre la microscopía de fluorescencia confocal y de campo amplio estándar, como:
La idea de utilizar la reflexión interna total para iluminar las células que entran en contacto con la superficie del vidrio fue descrita por primera vez por EJ Ambrose en 1956. [4] Esta idea fue luego ampliada por Daniel Axelrod [5] en la Universidad de Michigan, Ann Arbor, a principios de los años 1980. como TIRFM. Un TIRFM utiliza una onda evanescente para iluminar y excitar selectivamente los fluoróforos en una región restringida de la muestra inmediatamente adyacente a la interfaz vidrio-agua. El campo electromagnético evanescente decae exponencialmente desde la interfaz y, por tanto, penetra hasta una profundidad de sólo aproximadamente 100 nm en el medio de muestra. Así, el TIRFM permite una visualización selectiva de regiones superficiales como la membrana plasmática basal (que tiene aproximadamente 7,5 nm de espesor) de las células. Sin embargo, tenga en cuenta que la región visualizada tiene al menos unos pocos cientos de nanómetros de ancho, por lo que la zona citoplasmática inmediatamente debajo de la membrana plasmática se visualiza necesariamente además de la membrana plasmática durante la microscopía TIRF. La visualización selectiva de la membrana plasmática representa las características y eventos de la membrana plasmática en células vivas con alta resolución axial .
TIRF también se puede utilizar para observar la fluorescencia de una sola molécula , [6] [7], lo que la convierte en una herramienta importante de la biofísica y la biología cuantitativa. La microscopía TIRF también se ha aplicado en la detección de biomarcadores de ADN y discriminación de SNP en una sola molécula. [8]
Se ha demostrado que la geometría cis (TIRFM a través del objetivo) y la transgeometría (TIRFM basada en prismas y guías de luz) proporcionan una calidad diferente del efecto de la reflexión interna total. En el caso de la transgeometría, el camino de la luz de excitación y el canal de emisión están separados, mientras que en el caso del TIRFM de tipo objetivo comparten el objetivo y otros elementos ópticos del microscopio. Se demostró que la geometría basada en prismas genera ondas evanescentes limpias, cuya desintegración exponencial está cerca de la función teóricamente predicha. [9] Sin embargo, en el caso del TIRFM basado en objetivos, la onda evanescente está contaminada con una intensa luz parásita . Se demostró que la intensidad de la luz parásita asciende al 10-15% de la onda evanescente, lo que dificulta la interpretación de los datos obtenidos mediante TIRFM de tipo objetivo [10] [11]
Los componentes básicos del dispositivo TIRFM incluyen:
Las diferencias clave entre el TIRFM basado en objetivos (cis) y el basado en prismas (trans) son que el TIRFM basado en prismas requiere el uso de una interfaz prisma/solución para generar el campo evanescente, mientras que el TIRFM basado en objetivos no requiere un prisma y utiliza una cubierta. interfaz de deslizamiento/solución para generar el campo evanescente. Normalmente, los TIRFM basados en objetivos se utilizan más popularmente, sin embargo, tienen una calidad de imagen reducida debido al ruido de luz parásita dentro de la onda evanescente.
TIRFM se basa en el fenómeno óptico de reflexión interna total , en el que las ondas que llegan a una interfaz del medio no se transmiten al medio 2 sino que se reflejan completamente de regreso al medio 1. La reflexión interna total requiere que el medio 2 tenga un índice de refracción más bajo que el medio 1. , y las ondas deben incidir en ángulos suficientemente oblicuos en la interfaz. Un fenómeno observado que acompaña a la reflexión interna total es la onda evanescente , que se extiende espacialmente perpendicularmente desde la interfaz hacia el medio 2 y decae exponencialmente, como un factor de longitud de onda, índice de refracción y ángulo de incidencia. Es la onda evanescente la que se utiliza para lograr una mayor excitación de los fluoróforos cerca de la superficie de la muestra y una disminución de la excitación de los fluoróforos superfluos dentro de la solución.
Para fines prácticos, en TIRF basado en objetivos, el medio 1 suele ser un cubreobjetos de vidrio de alto índice de refracción y el medio 2 es la muestra en solución con un índice de refracción más bajo. Puede haber aceite de inmersión entre la lente y el cubreobjetos de vidrio para evitar una refracción significativa a través del aire.
El ángulo crítico para la incidencia de la luz excitadora se puede derivar de la ley de Snell :
Para el índice de refracción de la muestra, el índice de refracción del cubreobjetos.
Así, a medida que el ángulo de incidencia alcanza , comenzamos a observar efectos de reflexión interna total y onda evanescente, y a medida que se supera estos efectos son más prevalentes.
La intensidad de la onda evanescente viene dada por:
Con profundidad de penetración dada por:
Por lo general, ≤~100 nanómetros, que suele ser mucho más pequeño que la longitud de onda de la luz y mucho más delgado que un corte de microscopios confocales . [1] [12]
Para obtener imágenes TIRFM, la longitud de onda del haz de excitación dentro de la muestra se puede seleccionar mediante filtrado. Además, el rango de ángulos de incidencia está determinado por la apertura numérica (NA) del objetivo y requiere que NA > . Este parámetro se puede ajustar cambiando el ángulo en el que el haz de excitación ingresa a la lente del objetivo. Finalmente, los fabricantes pueden encontrar o informar experimentalmente los índices reflectantes ( ) de la solución y el cubreobjetos.
Para técnicas complejas de microscopía con fluoroscopio, los láseres son la fuente de luz preferida, ya que son muy uniformes, intensos y casi monocromáticos. Sin embargo, cabe señalar que las fuentes de luz ARC LAMP y otros tipos de fuentes también pueden funcionar. Normalmente, la longitud de onda del haz de excitación está designada por los requisitos de los fluoróforos dentro de la muestra; las longitudes de onda de excitación más comunes se encuentran en el rango de 400 a 700 nm para muestras biológicas.
En la práctica, una caja de luz generará un láser multicromático de alta intensidad, que luego se filtrará para permitir que las longitudes de onda deseadas exciten la muestra. Para TIRFM basado en objetivos, el haz de excitación y el haz de emisión fluorescente se capturarán a través de la misma lente objetivo. Por lo tanto, para dividir los haces, se utiliza un espejo dicromático para reflejar el haz de excitación entrante hacia la lente del objetivo y permitir que el haz de emisión pase hacia el detector. Es posible que se requiera un filtrado adicional para separar aún más las longitudes de onda de emisión y excitación.
Cuando se excitan con longitudes de onda de luz específicas, los tintes fluoróforos reemitirán luz en longitudes de onda más largas (que contienen menos energía). En el contexto de TIRFM, solo los fluoróforos cercanos a la interfaz serán fácilmente excitados por el campo evanescente, mientras que los que superan los ~100 nm estarán muy atenuados. La luz emitida por los fluoróforos no estará dirigida y, por tanto, pasará a través de la lente del objetivo en distintos lugares con distintas intensidades. Esta señal pasará luego a través del espejo dicromático y llegará al detector.
Los cubreobjetos de vidrio suelen tener un índice de reflexión aproximado , mientras que el índice de refracción del aceite de inmersión es comparable . El medio de aire, que tiene un índice de refracción de , causaría la refracción del haz de excitación entre el objetivo y el cubreobjetos, por lo que el aceite se usa para amortiguar la región y evitar interacciones de interfaz superfluas antes de que el haz alcance la interfaz entre el cubreobjetos y la muestra. .
La apertura numérica de la lente del objetivo (NA) especifica el rango de ángulos sobre los cuales el sistema puede aceptar o emitir luz.
Para lograr los mayores ángulos de incidencia, es deseable hacer pasar la luz en un ángulo fuera del eje a través de las periferias de la lente.
El plano focal posterior (también llamado "plano de apertura") es el plano a través del cual se enfoca el haz excitador antes de pasar por el objetivo. Ajustar la distancia entre el objetivo y el BPF puede producir una ampliación de imagen diferente, ya que el ángulo de incidencia será menos o más pronunciado. El haz debe pasar a través del BPF fuera del eje para poder pasar a través del objetivo en sus extremos, permitiendo que el ángulo sea suficientemente mayor que el ángulo crítico. El haz también debe enfocarse en el BPF porque esto asegura que la luz que pasa a través del objetivo esté colimada, interactuando con el cubreobjetos en el mismo ángulo y, por lo tanto, reflejándose totalmente internamente. [12]
La muestra debe adsorberse en la superficie del portaobjetos de vidrio y teñirse con fluoróforos apropiados para resolver las características deseadas dentro de la muestra. Esto está en protocolo con cualquier otra técnica de microscopía fluorescente .
El filtro dicroico es un filtro de borde que se utiliza en un ángulo de incidencia oblicuo (normalmente 45°) para reflejar eficientemente la luz en la banda de excitación y transmitir luz en la banda de emisión. El ángulo de 45° del filtro separa el camino del haz de excitación y emisión. El filtro está compuesto por un sistema complejo de múltiples capas de metales, sales metálicas y dieléctricos que se han depositado al vacío sobre un vidrio fino. [13] Este recubrimiento está diseñado para tener alta reflectividad para longitudes de onda más cortas y alta transmisión para longitudes de onda más largas. [14] Mientras que el filtro transmite la luz de excitación seleccionada (longitud de onda más corta) a través del objetivo y hacia el plano de la muestra, también pasa la luz de emisión fluorescente (longitud de onda más larga) al filtro de barrera y refleja cualquier luz de excitación dispersa en la dirección de la fuente láser. [15] Esto maximiza la cantidad de radiación excitante que pasa a través del filtro y el haz de fluorescencia emitido que detecta el detector. [dieciséis]
El filtro de barrera bloquea principalmente longitudes de onda no deseadas, especialmente longitudes de onda de luz de excitación más cortas. Normalmente es un filtro de paso de banda que deja pasar sólo las longitudes de onda emitidas por el fluoróforo y bloquea toda la luz no deseada fuera de esta banda. Los microscopios más modernos permiten cambiar el filtro de barrera en función de la longitud de onda de la emisión específica del fluoróforo. [13]
La imagen es detectada por una cámara digital de dispositivo de carga acoplada (CCD). Las cámaras CCD tienen detectores de fotones, que son finas obleas de silicio ensambladas en matrices 2D de regiones sensibles a la luz. Los conjuntos de detectores capturan y almacenan información de imágenes en forma de carga eléctrica localizada que varía con la intensidad de la luz incidente. [2] Como se muestra en el esquema, los detectores transforman los fotones en electrones y los electrones se convierten en una señal eléctrica legible en la placa de circuito. [17] La señal eléctrica luego se convoluciona con una función de dispersión de puntos (PSF) para muestrear la señal original. Como tal, la resolución de la imagen depende en gran medida de la cantidad de detectores y la función de dispersión de puntos determinará la resolución de la imagen. [18]
La mayoría de las técnicas de imágenes de fluorescencia exhiben ruido de fondo debido a la iluminación y reconstrucción de grandes cortes (en la dirección z) de las muestras. Dado que TIRFM utiliza una onda evanescente para hacer fluorescente una porción delgada de la muestra, hay inherentemente menos ruido de fondo y artefactos. Sin embargo, todavía existen otros ruidos y artefactos como el ruido de Poisson, las aberraciones ópticas, el fotoblanqueo y otras moléculas de fluorescencia.
El ruido poissoniano son incertidumbres fundamentales en la medición de la luz. Esto provocará incertidumbres durante la detección de fotones de fluorescencia. [18] Si se miden N fotones en una medición particular, hay un 63% de probabilidad de que el valor promedio verdadero esté en el rango entre N +√N y N −√N. [19] Este ruido puede causar una tergiversación del objeto en ubicaciones de píxeles incorrectas.
Las aberraciones ópticas pueden surgir de la difracción de la luz fluorescente o del microscopio y de la desalineación del objetivo. La difracción de la luz en el portaobjetos de muestra puede difundir la señal de fluorescencia y provocar imágenes borrosas en las complicadas imágenes. De manera similar, si hay una desalineación entre la lente del objetivo, el filtro y el detector, el haz de excitación o emisión puede no estar enfocado y causar imágenes borrosas. [14]
El fotoblanqueo puede ocurrir cuando los enlaces covalentes o no covalentes en los fluoróforos son destruidos por la luz de excitación y ya no pueden emitir fluorescencia. [20] Las sustancias fluorescentes siempre se degradarán hasta cierto punto por la energía de la radiación excitante y harán que la fluorescencia se desvanezca y produzca una imagen oscura y borrosa. [21] El fotoblanqueo es inevitable, pero puede minimizarse evitando la exposición a la luz no deseada y utilizando aceites de inmersión para minimizar la dispersión de la luz. [13]
La autofluorescencia puede ocurrir en ciertas estructuras celulares donde el compuesto natural en la estructura emitiría fluorescencia después de ser excitado a longitudes de onda relativamente más cortas (similar a la de la longitud de onda de excitación). [18] La fluorescencia inducida también puede ocurrir cuando ciertos compuestos no autofluorescentes se vuelven fluorescentes después de unirse a ciertas sustancias químicas (como el formaldehído). [13] Esta fluorescencia puede provocar artefactos o ruido de fondo en la imagen. El ruido de otros compuestos de fluorescencia se puede eliminar eficazmente utilizando filtros para capturar la longitud de onda de fluorescencia deseada o asegurándose de que los compuestos de autofluorescencia no estén presentes en la muestra.
Las técnicas modernas de fluorescencia intentan incorporar métodos para eliminar algunas imágenes borrosas y ruidos. Las aberraciones ópticas son generalmente deterministas (son constantes durante todo el proceso de imagen y en diferentes muestras). [18] La borrosidad determinista se puede eliminar desconvolucionando la señal y restando el artefacto conocido. La técnica de deconvolución consiste simplemente en utilizar una transformada de Fourier inversa para obtener la señal de fluorescencia original y eliminar el artefacto. [19]
Sin embargo, se ha demostrado que la deconvolución sólo funciona si hay una fuerte señal de fluorescencia o cuando el ruido está claramente identificado. Además, la deconvolución tiene un rendimiento deficiente porque no incluye información estadística y no puede reducir el ruido no determinista como el ruido poissoniano. Para obtener una mejor resolución y calidad de imagen, los investigadores han utilizado técnicas estadísticas para modelar la probabilidad de que los fotones se distribuyan en el detector. [18] [22] Esta técnica, llamada método de máxima verosimilitud , se está mejorando aún más mediante algoritmos para mejorar su velocidad de rendimiento. [22]
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