Microscopía de dispersión Raman coherente

Técnica de microscopía multifotónica

Imágenes de pila Z de dispersión Raman estimuladas sin etiquetas de dos colores simultáneos de la oreja de un ratón (rojo: proteína, verde: lípido, la imagen es de 220 por 220 micrones, la profundidad total es de 60 micrones, el tiempo de permanencia del píxel es de 2 microsegundos).

La microscopía de dispersión Raman coherente (CRS) es una técnica de microscopía multifotónica basada en modos vibracionales activos Raman de moléculas . Las dos técnicas principales en la microscopía CRS son la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) . SRS y CARS se predijeron teóricamente y se realizaron experimentalmente en la década de 1960. ^{[1] [2] [3]} En 1982 se demostró el primer microscopio CARS. ^[4] En 1999, la microscopía CARS utilizando una geometría colineal y un objetivo de alta apertura numérica se desarrolló en el laboratorio de Xiaoliang Sunney Xie en la Universidad de Harvard. ^[5] Este avance hizo que la técnica fuera más compatible con los microscopios de escaneo láser modernos . ^[6] Desde entonces, la popularidad de CRS en la investigación biomédica comenzó a crecer. La CRS se utiliza principalmente para obtener imágenes de lípidos, proteínas y otras biomoléculas en células o tejidos vivos o fijados sin etiquetar ni teñir . ^[7] La ​​CRS también se puede utilizar para obtener imágenes de muestras etiquetadas con etiquetas Raman, ^{[8] [9] [10]} que pueden evitar la interferencia de otras moléculas y normalmente permiten señales de CRS más fuertes que las que se obtendrían normalmente para biomoléculas comunes. La CRS también encuentra aplicación en otros campos, como la ciencia de los materiales ^[11] y la ciencia ambiental. ^[12]

Fondo

Diagramas de energía de procesos de dispersión Raman espontáneos y coherentes.

La dispersión Raman coherente se basa en la dispersión Raman (o dispersión Raman espontánea). En la dispersión Raman espontánea, solo se utiliza un láser de excitación monocromática. La intensidad de la señal de la dispersión Raman espontánea crece linealmente con la potencia promedio de un láser de bombeo de onda continua . En CRS, ^[7] se utilizan dos láseres para excitar modos vibracionales específicos de las moléculas que se van a fotografiar. El láser con una energía fotónica más alta normalmente se denomina láser de bombeo y el láser con una energía fotónica más baja se denomina láser de Stokes. Para producir una señal, sus diferencias de energía fotónica deben coincidir con la energía de un modo vibracional:

${\displaystyle E_{Raman}=E_{pump}-E_{Stokes}}$,

donde el . ${\displaystyle E_{Raman}=\hbar \Omega ,\ E_{pump}=\hbar \omega _{pump},\ E_{Stokes}=\hbar \omega _{Stokes}}$

La CRS es un proceso óptico no lineal , en el que el nivel de la señal normalmente es una función del producto de las potencias de los láseres de bombeo y de Stokes. Por lo tanto, la mayoría de los experimentos de microscopía de CRS se realizan con láseres pulsados , en los que una mayor potencia de pico mejora significativamente los niveles de señal de la CRS. ^[13]

Microscopía de dispersión Raman coherente anti-Stokes (CARS)

CARS avanzados y epidetectados

En CARS, los fotones anti-Stokes (de mayor energía y longitud de onda más corta que la bomba) se detectan como señales.

${\displaystyle E_{CARS}=E_{pump}+\Omega =2\times E_{pump}-E_{Stokes}}$

En la microscopía CARS, normalmente hay dos formas de detectar los fotones recién generados. Una se llama CARS de detección frontal, la otra llamada CARS de detección epi. ^{[14] [15]} En CARS de detección frontal, los fotones CARS generados junto con los láseres de bombeo y Stokes pasan a través de la muestra. Los láseres de bombeo y Stokes están completamente bloqueados por un filtro de muesca de alta densidad óptica (OD) . Luego, los fotones CARS son detectados por un tubo fotomultiplicador (PMT) o una cámara CCD . En CARS de detección epi, los fotones CARS retrodispersados ​​son redirigidos por un espejo dicroico o divisor de haz polarizador . Después de que se utilizan filtros de alta OD para bloquear los láseres de bombeo y Stokes retrodispersados, los fotones recién generados son detectados por un PMT. La intensidad de la señal de CARS tiene la siguiente relación con las intensidades del láser de bombeo y de Stokes , el número de moléculas en el foco de los láseres y la susceptibilidad Raman de tercer orden de la molécula: ^[16] ${\displaystyle I_{pump},I_{Stokes}}$ ${\displaystyle N}$ ${\displaystyle \chi _{Raman}^{(3)}}$

${\displaystyle I_{CARS}\propto (N\chi _{Raman}^{(3)})^{2}I_{pump}^{2}I_{Stokes}}$

La relación señal-ruido (SNR), que es una característica más importante en los experimentos de imágenes, depende de la raíz cuadrada del número de fotones CARS generados, que se detalla a continuación: ^[16]

${\displaystyle SNR_{CARS}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}{\sqrt {I_{Stokes}}}}$

Existen otros procesos ópticos no lineales que también generan fotones en la longitud de onda anti-Stokes. Esas señales normalmente se denominan fondo de mezcla de cuatro ondas (FWM) no resonante (NR) en la microscopía CARS. Estos fondos pueden interferir con la señal CARS de forma constructiva o destructiva. ^[17] Sin embargo, el problema se puede evitar parcialmente restando las imágenes de resonancia activa y desactivada ^{[18] [19]} o utilizando métodos matemáticos para recuperar las imágenes libres de fondo. ^[20]

Microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS)

En SRS, la intensidad de la transferencia de energía desde la longitud de onda de bombeo a la longitud de onda del láser Stokes se mide como una señal. Hay dos formas de medir las señales SRS: una es medir el aumento de potencia en el láser Stokes, que se denomina ganancia Raman estimulada (SRG). La otra es medir la disminución de potencia en el láser de bombeo, que se denomina pérdida Raman estimulada (SRL). Dado que el cambio de potencia es del orden de 10 ⁻³ a 10 ⁻⁶ en comparación con la potencia original de los láseres de bombeo y Stokes, normalmente se emplea un esquema de transferencia de modulación ^[21] para extraer las señales SRS. ^[22] La señal SRS depende de las potencias del láser de bombeo y Stokes de la siguiente manera:

${\displaystyle I_{SRS}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}I_{Stokes}}$

Se puede lograr una detección limitada por ruido de disparo si el ruido electrónico de los detectores se reduce muy por debajo del ruido óptico y los láseres están limitados por ruido de disparo en la frecuencia de detección (frecuencia de modulación). En el caso de ruido de disparo limitado, la relación señal-ruido (SNR) de SRS ^[16] es

${\displaystyle SNR_{SRL}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}{\sqrt {I_{pump}}}I_{Stokes}}$

${\displaystyle SNR_{SRG}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}{\sqrt {I_{Stokes}}}}$

La señal de SRS está libre del fondo no resonante que afecta a la microscopía CARS, aunque puede existir un fondo no resonante mucho más pequeño proveniente de otros procesos ópticos (por ejemplo, modulación de fase cruzada , absorción multifotón multicolor ) .

La detección de SRS se puede realizar tanto en dirección de avance como en dirección epi. En la detección de SRS en dirección de avance, el láser modulado se bloquea con un filtro de muesca de alta densidad óptica y el otro láser se mide con un fotodiodo. La modulación transferida del láser modulado al láser originalmente no modulado normalmente se extrae mediante un amplificador de bloqueo de la salida del fotodiodo. En la detección de SRS en dirección epi, normalmente hay dos métodos para detectar la señal de SRS. Un método consiste en detectar la luz retrodispersada delante del objetivo mediante un fotodiodo con un orificio en el centro. El otro método es similar a la microscopía CARS con detección epi, en la que la luz retrodispersada atraviesa el objetivo y se desvía hacia un lado de la trayectoria de la luz, normalmente con la combinación de un divisor de haz polarizador y una placa de cuarto de onda. A continuación, se detecta el láser de Stokes (o de bombeo) después de filtrar el láser de bombeo (o de Stokes).

Microscopía CRS bicolor, multicolor e hiperespectral

Un par de longitudes de onda láser solo da acceso a una única frecuencia vibracional. La obtención de imágenes de muestras en diferentes números de onda puede proporcionar un mapeo químico más específico y cuantitativo de la muestra. ^{[23] [24] [25] [26] [27] [28]} Esto se puede lograr mediante la obtención de imágenes en diferentes números de onda uno tras otro. Esta operación siempre implica algún tipo de ajuste: ajuste de una de las longitudes de onda de los láseres, ajuste de un dispositivo de filtrado espectral o ajuste del retardo de tiempo entre los láseres de bombeo y Stokes en el caso de CRS de enfoque espectral. Otra forma de realizar CRS multicolor es utilizar un láser de picosegundos con un ancho de banda espectral estrecho (<1 nm) como bomba o Stokes y el otro láser con un ancho de banda espectral amplio. En este caso, el espectro del láser de banda ancha transmitido se puede distribuir mediante una rejilla y medir mediante una matriz de detectores.

CRS de enfoque espectral

Los CRS normalmente utilizan láseres con láseres de ancho de banda estrecho, cuyo ancho de banda < 1 nm, para mantener una buena resolución espectral ~ 15 cm ^{−1 . Los láseres con ancho de banda inferior a 1 nm son láseres de picosegundos. En los CRS de enfoque espectral, los láseres de bombeo de femtosegundos y los láseres de Stokes se} convierten linealmente en láseres de picosegundos. ^{[29] [30] [31]} El ancho de banda efectivo se vuelve más pequeño y, por lo tanto, se puede lograr una alta resolución espectral de esta manera con láseres de femtosegundos que normalmente tienen un ancho de banda amplio. El ajuste del número de onda de los CRS de enfoque espectral se puede lograr tanto cambiando la longitud de onda central de los láseres como cambiando el retraso entre los láseres de bombeo y de Stokes.

Aplicaciones

Histología Raman coherente

Una de las principales aplicaciones de la CRS es la histología sin etiquetas, que también se denomina histología Raman coherente o, a veces, histología Raman estimulada. ^{[32] [33] [34] [35]} En la CRH, las imágenes de CRS se obtienen en imágenes de lípidos y proteínas y, después de un cierto procesamiento de imágenes, se puede obtener una imagen similar a la tinción H&E . A diferencia de la tinción H&E, la CRH se puede realizar en tejido vivo y fresco y no necesita fijación ni tinción.

Metabolismo celular

El metabolismo de moléculas pequeñas como la glucosa, ^[36] el colesterol, ^[37] y los fármacos ^[38] se estudian con CRS en células vivas. La CRS proporciona una forma de medir la distribución y las cantidades moleculares con un rendimiento relativamente alto.

Imágenes de mielina

La mielina es rica en lípidos. La CRS se utiliza de forma rutinaria para obtener imágenes de la mielina en tejidos vivos o fijados para estudiar enfermedades neurodegenerativas u otros trastornos neuronales. ^{[39] [40] [41]}

Investigación farmacéutica

Las funciones de los fármacos también se pueden estudiar mediante CRS. Por ejemplo, un fármaco contra la leucemia, el imatinib, se estudia con SRS en líneas celulares de leucemia. ^[38] El estudio reveló el posible mecanismo de su metabolismo en las células y proporcionó información sobre formas de mejorar la eficacia de los fármacos.

Etiquetas Raman

Aunque la CRS permite la obtención de imágenes sin etiquetas, las etiquetas Raman también se pueden utilizar para potenciar la señal de objetivos específicos. ^{[42] [9] [8]} Por ejemplo, se utilizan moléculas deuteradas para desplazar la señal Raman a una banda en la que no hay interferencias de otras moléculas. Se pueden utilizar moléculas especialmente diseñadas que contienen isótopos como etiquetas Raman para lograr imágenes multicolor con supermultiplexación mediante SRS. ^[10]

Comparación con la microscopía confocal Raman

La microscopía Raman confocal normalmente utiliza láseres de onda continua para proporcionar un espectro Raman espontáneo en un amplio rango de números de onda para cada punto de una imagen. Se necesita mucho tiempo para escanear toda la muestra, ya que cada píxel requiere segundos para la adquisición de datos. Todo el proceso de obtención de imágenes es largo y, por lo tanto, es más adecuado para muestras que no se mueven. La CRS, por otro lado, mide señales en un solo número de onda, pero permite un escaneo rápido. Si se necesita más información espectral, se puede utilizar la CRS multicolor o hiperespectral y la velocidad de escaneo o la calidad de los datos se verán comprometidas en consecuencia. ^[43]

Comparación entre SRS y CARS

En la microscopía CRS, podemos considerar SRS y CARS como dos aspectos del mismo proceso. La señal CARS siempre se mezcla con un fondo de mezcla de cuatro ondas no resonante y tiene una dependencia cuadrática de la concentración de las sustancias químicas que se están visualizando. SRS tiene un fondo mucho menor y depende linealmente de la concentración de la sustancia química que se está visualizando. Por lo tanto, SRS es más adecuado para la obtención de imágenes cuantitativas que CARS. En cuanto al instrumento, SRS requiere modulación y demodulación (por ejemplo, amplificador lock-in o detector resonante). Para la obtención de imágenes multicanal, SRS requiere demodulación multicanal mientras que CARS solo necesita una matriz PMT o un CCD. Por lo tanto, la instrumentación necesaria es más complicada para SRS que para CARS. ^[16]

En cuanto a la sensibilidad, los SRS y los CARS suelen ofrecer sensibilidades similares. ^[44] Sus diferencias se deben principalmente a los métodos de detección. En la microscopía CARS, se utilizan PMT, APD o CCD como detectores para detectar los fotones generados en el proceso CARS. Los PMT son los más utilizados debido a su gran área de detección y alta velocidad. En la microscopía SRS, normalmente se utilizan fotodiodos para medir las intensidades del haz láser. Debido a estas diferencias, las aplicaciones de CARS y SRS también son diferentes. ^[16]

Los fotodiodos fotocromáticos (PMT) normalmente tienen una eficiencia cuántica relativamente baja en comparación con los fotodiodos. Esto afectará negativamente la relación señal-ruido (SNR) de la microscopía CARS. Los fotodiodos fotocromáticos también tienen una sensibilidad reducida para los láseres con longitudes de onda mayores a 650 nm. Por lo tanto, con el sistema láser comúnmente utilizado para CRS ( láser de zafiro de titanio ), CARS se utiliza principalmente para obtener imágenes en la región de alto número de onda (2800–3400 cm ⁻¹ ). La relación señal-ruido (SNR) de la microscopía CARS normalmente es pobre para la obtención de imágenes de huellas dactilares (400–1800 cm ⁻¹ ). ^[16]

La microscopía SRS utiliza principalmente fotodiodos de silicio como detectores. Los fotodiodos de silicio tienen una eficiencia cuántica mucho mayor que los fotodiodos fotocromáticos, lo que es una de las razones por las que la relación señal-ruido de los fotodiodos SRS puede ser mejor que la de los fotocromosomas carboxilos en muchos casos. Los fotodiodos de silicio también sufren una sensibilidad reducida cuando la longitud de onda del láser es superior a 850 nm. Sin embargo, la sensibilidad sigue siendo relativamente alta y permite obtener imágenes en la región de las huellas dactilares (400–1800 cm ⁻¹ ). ^[16]

Véase también

• Espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS)
• Óptica no lineal
• Microscopio Raman
• Espectroscopia Raman
• Dispersión
• Espectroscopia Raman estimulada

Referencias

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