Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada . Con él, el rango típico de resolución axial de 500 a 700 nm se puede mejorar a 100 a 150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con 5 a 7 veces menos volumen que el de la microscopía confocal estándar . [1]
La mejora en la resolución se logra mediante el uso de dos lentes objetivo opuestos, ambos enfocados en la misma ubicación geométrica. Además, la diferencia en la longitud del camino óptico a través de cada una de las dos lentes objetivas se alinea cuidadosamente para que sea mínima. Con este método se pueden iluminar de forma coherente las moléculas que se encuentran en la zona focal común de ambos objetivos desde ambos lados y también se puede recoger de forma coherente la luz reflejada o emitida, es decir, es posible una superposición coherente de la luz emitida sobre el detector. El ángulo sólido que se utiliza para la iluminación y la detección aumenta y se acerca a su máximo. En este caso la muestra se ilumina y se detecta simultáneamente desde todos los lados.
En la figura se muestra el modo de funcionamiento de un microscopio 4Pi. La luz láser se divide mediante un divisor de haz y se dirige mediante espejos hacia los dos objetivos opuestos. En el punto focal común se produce una superposición de ambos haces de luz enfocados. Las moléculas excitadas en esta posición emiten luz fluorescente, que es recogida por ambas lentes objetivas, combinadas por el mismo divisor de haz y desviada por un espejo dicroico hacia un detector. Allí puede volver a producirse una superposición de ambas vías luminosas emitidas.
En el caso ideal, cada lente objetivo puede captar luz desde un ángulo sólido de . Con dos lentes objetivos se pueden recolectar desde todas las direcciones (ángulo sólido ). El nombre de este tipo de microscopía se deriva del ángulo sólido máximo posible para la excitación y la detección. En la práctica, para un objetivo sólo se pueden conseguir ángulos de apertura de unos 140°, lo que corresponde a .
El microscopio se puede operar de tres maneras diferentes: En un microscopio 4Pi del tipo A, se utiliza la superposición coherente de la luz de excitación para generar una resolución aumentada. La luz emitida se detecta desde un solo lado o en una superposición incoherente desde ambos lados. En un microscopio 4Pi de tipo B, sólo interfiere la luz de emisión. Cuando se opera en el modo tipo C, se permite que interfieran tanto la luz de excitación como la de emisión, lo que lleva al mayor aumento de resolución posible (~7 veces a lo largo del eje óptico en comparación con la microscopía confocal).
En un microscopio 4Pi real, la luz no se puede aplicar ni recoger desde todas las direcciones por igual, lo que genera los llamados lóbulos laterales en la función de dispersión de puntos . Normalmente (pero no siempre) se utiliza microscopía de excitación de dos fotones en un microscopio 4Pi en combinación con un orificio de emisión para reducir estos lóbulos laterales a un nivel tolerable.
En 1971, Christoph Cremer y Thomas Cremer propusieron la creación de un holograma perfecto , es decir, uno que transporta toda la información de campo de la emisión de una fuente puntual en todas las direcciones, el llamado holograma. [2] [3] Sin embargo, la publicación de 1978 [4] había llegado a una conclusión física incorrecta (es decir, un punto de luz en forma de punto) y había pasado por alto por completo el aumento de la resolución axial como el beneficio real de agregar el otro lado del sólido. ángulo. [5] La primera descripción de un sistema practicable de microscopía 4Pi, es decir, la configuración con dos lentes de interferencia opuestas, fue inventada por Stefan Hell en 1991. [6] Lo demostró experimentalmente en 1994. [7]
En los años siguientes, el número de aplicaciones de este microscopio aumentó. Por ejemplo, la excitación y detección paralelas con 64 puntos en la muestra simultáneamente combinadas con la resolución espacial mejorada dieron como resultado el registro exitoso de la dinámica de las mitocondrias en células de levadura con un microscopio 4Pi en 2002. [8] Se lanzó una versión comercial con microscopio fabricante Leica Microsystems en 2004 [9] y posteriormente descontinuado.
Hasta ahora, la mejor calidad en un microscopio 4Pi se lograba junto con técnicas de superresolución como el principio de agotamiento estimulado de emisiones (STED). [10] Utilizando un microscopio 4Pi con haces de excitación y desexcitación adecuados, fue posible crear un punto de tamaño uniforme de 50 nm, que corresponde a un volumen focal reducido en comparación con la microscopía confocal en un factor de 150 a 200 en células fijas. Con la combinación de microscopía 4Pi y microscopía RESOLFT con proteínas conmutables, ahora es posible tomar imágenes de células vivas con niveles de luz bajos y resoluciones isotrópicas inferiores a 40 nm. [11]
