Resumiendo, el método convencional es el siguiente:
El ADN y las proteínas asociadas en la cromatina de células o tejidos vivos están reticulados (este paso se omite en Native ChIP).
Luego, los complejos de ADN-proteína (cromatina-proteína) se cortan en fragmentos de ADN de ~500 pb mediante sonicación o digestión con nucleasa.
Los fragmentos de ADN reticulados asociados con las proteínas de interés se inmunoprecipitan selectivamente de los restos celulares utilizando un anticuerpo específico para la proteína apropiado.
Los fragmentos de ADN asociados se purifican y se determina su secuencia. El enriquecimiento de secuencias de ADN específicas representa regiones del genoma con las que la proteína de interés está asociada in vivo .
El ChIP reticulado es principalmente adecuado para mapear el objetivo de ADN de los factores de transcripción u otras proteínas asociadas a la cromatina, y utiliza cromatina reticulada reversiblemente como material de partida. El agente para la reticulación reversible podría ser formaldehído [3] o luz UV . [4] Luego, la cromatina reticulada generalmente se corta mediante sonicación, proporcionando fragmentos de 300 a 1000 pares de bases (pb) de longitud. Se ha utilizado una reticulación suave con formaldehído seguida de digestión con nucleasas para cortar la cromatina. [5] Los fragmentos de cromatina de 400 a 500 pb han demostrado ser adecuados para los ensayos de ChIP, ya que cubren dos o tres nucleosomas .
Los restos celulares en el lisado cortado se eliminan luego por sedimentación y los complejos proteína-ADN se inmunoprecipitan selectivamente utilizando anticuerpos específicos para la(s) proteína(s) de interés. Los anticuerpos se acoplan comúnmente a agarosa , sefarosa o perlas magnéticas. Alternativamente, los complejos cromatina-anticuerpo se pueden retener y eluir selectivamente mediante discos de polímero inerte. [6] [7] Los complejos inmunoprecipitados (es decir, el complejo perla-anticuerpo-proteína-secuencia de ADN diana) se recogen y se lavan para eliminar la cromatina unida de forma no específica, se revierte el enlace cruzado proteína-ADN y las proteínas se eliminan por digestión con proteinasa K. Se puede utilizar una versión etiquetada con epítopo de la proteína de interés, o biotinilación in vivo [8] en lugar de anticuerpos para la proteína nativa de interés.
El ChIP nativo es principalmente adecuado para mapear el ADN objetivo de los modificadores de histonas . Generalmente, se utiliza cromatina nativa como cromatina de partida. A medida que las histonas se envuelven alrededor del ADN para formar nucleosomas, se unen de forma natural. Luego, la cromatina se corta mediante digestión con nucleasa microcócica, que corta el ADN a lo largo del enlace, dejando los nucleosomas intactos y proporcionando fragmentos de ADN de un nucleosoma (200 pb) a cinco nucleosomas (1000 pb) de longitud. A partir de entonces, se utilizan métodos similares a XChIP para limpiar los restos celulares, inmunoprecipitar la proteína de interés, eliminar la proteína del complejo inmunoprecipitado y purificar y analizar el ADN asociado al complejo. [ cita requerida ]
Comparación de XChIP y NChIP
La principal ventaja de la NChIP es la especificidad de los anticuerpos . La mayoría de los anticuerpos contra las histonas modificadas se generan contra antígenos peptídicos sintéticos no fijados. Los epítopos que necesitan reconocer en la XChIP pueden verse alterados o destruidos por la reticulación con formaldehído , en particular porque es probable que las reticulaciones involucren grupos e-amino de lisina en los extremos N, lo que altera los epítopos. Es probable que esto explique la eficiencia consistentemente baja de los protocolos XChIP en comparación con la NChIP.
Sin embargo, XChIP y NChIP tienen objetivos y ventajas diferentes entre sí. XChIP sirve para mapear sitios diana de factores de transcripción y otras proteínas asociadas a la cromatina, mientras que NChIP sirve para mapear sitios diana de modificadores de histonas (véase la Tabla 1).
Comparación de ChIP-seq y ChIP-chip
La secuenciación por inmunoprecipitación de cromatina, también conocida como ChIP-seq , es una técnica experimental que se utiliza para identificar eventos de unión de factores de transcripción a lo largo de todo el genoma . Saber cómo las proteínas del cuerpo humano interactúan con el ADN para regular la expresión genética es un componente clave de nuestro conocimiento de las enfermedades humanas y los procesos biológicos. ChIP-seq es la técnica principal para completar esta tarea, ya que ha demostrado ser extremadamente eficaz para resolver cómo las proteínas y los factores de transcripción influyen en los mecanismos fenotípicos. En general, ChIP-seq se ha convertido en un método muy eficiente para determinar estos factores, pero existe un método rival conocido como ChIP-on-chip.
ChIP-on-chip , también conocido como ChIP-chip, es una técnica experimental utilizada para aislar e identificar sitios genómicos ocupados por proteínas específicas que se unen al ADN en células vivas. ChIP-on-chip es una técnica relativamente nueva, ya que fue introducida en 2001 por Peggy Farnham y Michael Zhang. ChIP-on-chip recibe su nombre al combinar los métodos de inmunoprecipitación de cromatina y microarreglo de ADN , creando así ChIP-on-chip.
Los dos métodos buscan resultados similares, ya que ambos se esfuerzan por encontrar sitios de unión de proteínas que puedan ayudar a identificar elementos en el genoma humano. Esos elementos en el genoma humano son importantes para el avance del conocimiento en enfermedades humanas y procesos biológicos. La diferencia entre ChIP-seq y ChIP-chip se establece por el sitio específico de la identificación de la unión de la proteína. La principal diferencia proviene de la eficacia de las dos técnicas, ChIP-seq produce resultados con mayor sensibilidad y resolución espacial debido a la amplia gama de cobertura genómica. Si bien ChIP-seq ha demostrado ser más eficiente que ChIP-chip, ChIP-seq no siempre es la primera opción para los científicos. El costo y la accesibilidad de ChIP-seq es una desventaja importante, lo que ha llevado al uso más predominante de ChIP-chip en laboratorios de todo el mundo. [2]
Esta foto compara la eficacia de las dos técnicas experimentales, ChIP-seq y ChIP-chip.
Tabla 1 Ventajas y desventajas de NChIP y XChIP
Historia y nuevos métodos ChIP
En 1984, John T. Lis y David Gilmour, en ese momento estudiante de posgrado en el laboratorio de Lis, utilizaron la irradiación UV, un agente de reticulación de ácido nucleico de proteína de longitud cero, para reticular covalentemente proteínas unidas al ADN en células bacterianas vivas. Después de la lisis de las células reticuladas y la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa bacteriana, el ADN asociado con la ARN polimerasa enriquecida se hibridó con sondas correspondientes a diferentes regiones de genes conocidos para determinar la distribución y densidad in vivo de la ARN polimerasa en estos genes. Un año después, utilizaron la misma metodología para estudiar la distribución de la ARN polimerasa II eucariota en los genes de choque térmico de la mosca de la fruta. Estos informes se consideran los estudios pioneros en el campo de la inmunoprecipitación de la cromatina. [9] [10] XChIP fue modificado y desarrollado por Alexander Varshavsky y colaboradores, quienes examinaron la distribución de la histona H4 en los genes de choque térmico utilizando reticulación con formaldehído. [11] [12] Esta técnica fue ampliamente desarrollada y refinada a partir de entonces. [13]
El método NChIP fue descrito por primera vez por Hebbes et al ., 1988, [14] y también se ha desarrollado y refinado rápidamente. [15] El ensayo ChIP típico suele tardar entre 4 y 5 días y requiere al menos entre 106 y 107 células . Ahora, las nuevas técnicas de ChIP se pueden lograr con tan solo 100 a 1000 células y completarse en un día.
ChIP sin microesferas : este novedoso método ChIP utiliza discos de polímero poroso inerte funcionalizado con proteína A o G en columnas de centrifugación o microplacas. El complejo de cromatina-anticuerpo es retenido selectivamente por el disco y eluido para obtener ADN enriquecido para aplicaciones posteriores, como qPCR y secuenciación. El entorno poroso está diseñado específicamente para maximizar la eficiencia de captura y reducir la unión no específica. Debido a la menor manipulación manual y a los protocolos optimizados, ChIP se puede realizar en 5 horas. [7]
ChIP portador (CChIP): este método podría utilizar tan solo 100 células agregando células de Drosophila como cromatina portadora para reducir la pérdida y facilitar la precipitación de la cromatina objetivo. Sin embargo, requiere iniciadores altamente específicos para la detección de la cromatina de la célula objetivo a partir del fondo de cromatina portadora extraña, y lleva de dos a tres días. [16]
ChIP rápido (qChIP): el ensayo ChIP rápido redujo el tiempo al acortar dos pasos en un ensayo ChIP típico: (i) un baño ultrasónico acelera la tasa de unión de anticuerpos a las proteínas objetivo y, por lo tanto, reduce el tiempo de inmunoprecipitación (ii) un procedimiento de aislamiento de ADN basado en resina (Chelex-100) reduce el tiempo de reversión de enlaces cruzados y aislamiento de ADN. Sin embargo, el protocolo rápido es adecuado solo para muestras de células grandes (en el rango de 10 6 ~10 7 ). [17] [18] Se pueden procesar hasta 24 muestras de cromatina cortada para producir ADN listo para PCR en 5 horas, lo que permite sondear múltiples factores de cromatina simultáneamente y/o observar eventos genómicos en varios puntos de tiempo. [19]
ChIP cuantitativo y rápido (Q 2 ChIP): el ensayo utiliza 100.000 células como material de partida y es adecuado para hasta 1.000 ChIP de histonas o 100 ChIP de factores de transcripción. De este modo, se pueden preparar y almacenar muchas muestras de cromatina en paralelo, y se puede realizar un Q 2 ChIP en un día. [20]
MicroChIP (μChIP): la cromatina se prepara generalmente a partir de 1000 células y se pueden realizar hasta 8 ChIP en paralelo sin portadores. El ensayo también puede comenzar con 100 células, pero solo es adecuado para un ChIP. También se pueden utilizar biopsias de tejido pequeñas (1 mm3 ) y el microChIP se puede realizar en un día. [21] [22]
Matrix ChIP : se trata de un ensayo ChIP basado en microplacas con mayor rendimiento y un procedimiento simplificado. Todos los pasos se realizan en pocillos de microplacas sin transferencias de muestras, lo que permite la automatización. Permite realizar 96 ensayos ChIP para histonas y varias proteínas unidas al ADN en un solo día. [23]
Patología-ChIP (PAT-ChIP): Esta técnica permite realizar ChIP a partir de tejidos de patología fijados con formalina e incluidos en parafina y, por lo tanto, el uso de archivos de patología (incluso aquellos que tienen varios años de antigüedad) para análisis epigenéticos y la identificación de biomarcadores o dianas epigenéticas candidatos. [24]
Los ensayos a gran escala con ChIP son un desafío si se utilizan organismos modelo intactos. Esto se debe a que se deben generar anticuerpos para cada TF o, alternativamente, se deben producir organismos modelo transgénicos que expresen TF marcados con epítopos.
Los investigadores que estudian los patrones de expresión genética diferencial en organismos pequeños también enfrentan problemas, ya que los genes se expresan en niveles bajos, en un número pequeño de células y en un período de tiempo estrecho.
Los experimentos de ChIP no pueden discriminar entre diferentes isoformas de TF ( isoforma de proteína ).
Véase también
ChIP-exo , una técnica que agrega el tratamiento con exonucleasa al proceso ChIP para obtener una resolución de hasta un solo par de bases de los sitios de unión
ChIP-on-chip , combina ChIP con tecnología de microarrays
DamID , una técnica de mapeo de ubicación alternativa que no requiere anticuerpos específicos
RIP-Chip , una técnica similar para analizar interacciones ARN-proteína
Referencias
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Enlaces externos
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