La ribozima en horquilla es una pequeña sección de ARN que puede actuar como ribozima . Al igual que la ribozima del tiburón martillo, se encuentra en los satélites de ARN de los virus de las plantas. Se identificó por primera vez en la cadena negativa del ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco (TRSV), donde cataliza reacciones de autoescisión y unión ( ligadura ) para procesar los productos de la replicación del virus del círculo rodante en moléculas de ARN satélite lineales y circulares. La ribozima en horquilla es similar a la ribozima en cabeza de martillo en que no requiere un ion metálico para la reacción.
La ribozima en horquilla es un motivo de ARN que cataliza reacciones de procesamiento de ARN esenciales para la replicación de las moléculas de ARN satélite en las que está incrustada. Estas reacciones son de autoprocesamiento, es decir, una molécula reorganiza su propia estructura. Tanto las reacciones de escisión como las de unión de extremos están mediadas por el motivo ribozima, lo que da lugar a una mezcla de moléculas de ARN satélite lineales y circulares interconvertibles. Estas reacciones son importantes para procesar las grandes moléculas de ARN multimérico que se generan mediante la replicación en círculo rodante . Al final del ciclo de replicación, estos grandes intermediarios de la replicación del ARN satélite se procesan hasta obtener moléculas de longitud unitaria (circulares o lineales) antes de que los virus puedan empaquetarlos y transportarlos a otras células para posteriores rondas de replicación. [1]
En la década de 1980, la ribozima en horquilla se identificó en tres secuencias naturales y bien caracterizadas:
Un trabajo posterior en 2021 reveló casi 1000 secuencias de ribozimas en horquilla en organismos en gran parte desconocidos que se encuentran en los datos del metatranscriptoma. [7] Se planteó la hipótesis [7] de que estas secuencias más nuevas se producen en organismos que, como los que contienen las tres ribozimas en horquilla encontradas anteriormente, utilizan genomas de ARN circulares monocatenarios. La circularidad de los genomas se demostró experimentalmente, pero aún no se ha estudiado bien la naturaleza ulterior de los organismos.
Se han desarrollado versiones artificiales más pequeñas de la ribozima en horquilla para permitir un análisis experimental más detallado de la molécula. [8] Esta es una estrategia comúnmente utilizada para separar aquellas partes de una molécula de ARN autoprocesable que son esenciales para las reacciones de procesamiento del ARN de aquellas partes que cumplen funciones no relacionadas. Mediante este proceso, se identificaron un dominio catalítico mínimo de 50 nucleótidos y un sustrato de 14 nucleótidos. [9] Utilizando estas secuencias derivadas artificialmente, se desarrolló una ribozima de acción trans que puede catalizar la escisión de múltiples moléculas de sustrato. Esta estrategia fue importante porque permitió a los investigadores (i) aplicar métodos bioquímicos para el análisis enzimático, (ii) realizar experimentos para identificar elementos estructurales esenciales del complejo ribozima-sustrato y (iii) desarrollar ribozimas diseñadas que se han utilizado con fines biomédicos. aplicaciones, incluida la prevención de la replicación de virus patógenos y el estudio de la función de genes individuales.
Al igual que varias otras ribozimas y proteínas ribonucleasas, la reacción de escisión de la ribozima en horquilla genera fragmentos de ARN con extremos que consisten en un fosfato cíclico 2',3' y un grupo hidroxilo 5'. La reacción de ligación parece ser una simple inversión de la escisión, es decir, la unión covalente de fragmentos de ARN que terminan con un fosfato cíclico 2',3' y un grupo 5'-hidroxilo para generar el enlace fosfodiéster 3'-5' ordinario utilizado en ambos casos. ARN y ADN.
Los estudios de esta reacción en múltiples ribozimas han servido para establecer que la química de la reacción (mecanismo catalítico) es una propiedad endógena de la propia molécula de ARN y no está mediada por iones metálicos, como ocurre con algunas enzimas proteicas y algunas otras ribozimas. [10] Además, la actividad de escisión todavía se observa cuando Mg 2+ se reemplaza por [Co(NH 3 ) 6 ] 3+ . [11] El Co 3+ se une al NH 3 con tanta fuerza en solución que el NH 3 no se disocia en un grado apreciable y, por lo tanto, no se protona. Esto sugiere que no hay transferencia de protones catalizada por metales ni coordinación directa con el ARN, sino que solo se requieren metales para el plegado. Además, en estructuras cristalinas de un complejo de ribozima-inhibidor y un imitador de estado de transición , se demostró que la arquitectura tridimensional separa A-1 y G+1, posicionando el 2'-OH de A-1 para un línea de ataque nucleofílico sobre el enlace fosfato escindible. Además, se ha sugerido que G8, A38 y A9 desempeñan funciones en la catálisis al desprotonar el 2'-OH de A-1, estabilizar la carga negativa en desarrollo de los oxígenos de fosfato pentacoordinados y protonar el grupo saliente 5'-O de G+1. [12] [13]
El complejo mínimo de ribozima-sustrato en horquilla se pliega en una estructura secundaria que incluye dos dominios, cada uno de los cuales consta de dos hélices cortas con pares de bases separadas por un bucle interno. El dominio A (hélice 1 – bucle A – hélice 2) contiene el sustrato y la región primaria de reconocimiento de sustrato de la ribozima. El dominio B (hélice 3 – bucle B – hélice 4) es más grande y contiene los determinantes catalíticos primarios de la ribozima. Los dos dominios están unidos covalentemente mediante un enlace fosfodiéster que conecta la hélice 2 con la hélice 3. Estos dominios deben interactuar entre sí para que se produzca la catálisis. [15]
Cuando se permite que el complejo mínimo de ribozima-sustrato se pliegue en condiciones de baja fuerza iónica , los dos dominios se apilan uno encima del otro, formando una estructura extendida e inactiva que se asemeja a una horquilla. [16] Para que se produzca la catálisis, los dos dominios se encuentran paralelos entre sí en un pliegue que se asemeja a un clip. En varias publicaciones, este ARN se ha denominado ribozima en "clip" o en "horquilla". A pesar de que el primer nombre ha demostrado ser más exacto, el segundo se ha convertido en la nomenclatura comúnmente aceptada. En el laboratorio, se promueve una interacción funcional entre los dos dominios mediante la adición de cationes , cuya carga positiva es suficiente para superar la repulsión electrostática de la columna vertebral del ARN con carga negativa. En la naturaleza, la asociación de los dos dominios está asistida por una combinación de iones metálicos (incluido Mg 2+ ) y la presencia de dos dominios helicoidales adicionales que no están presentes en el complejo mínimo de ribozima-sustrato pero que sirven para promover el plegamiento tridimensional adecuado. . Estos dominios adicionales se apilan sobre las hélices 2 y 3, promoviendo así la asociación de los dos dominios funcionales a través de lo que se denomina unión helicoidal de cuatro vías. [17]
La estructura y actividad de la ribozima en horquilla se ha explorado utilizando una amplia gama de métodos experimentales complementarios, incluido el reemplazo de nucleótidos, la sustitución de grupos funcionales, la selección combinatoria, la espectroscopia de fluorescencia , la reticulación covalente , el análisis de RMN y la cristalografía de rayos X. Estos estudios se han visto facilitados por la capacidad del complejo funcional de autoensamblarse a partir de segmentos elaborados mediante síntesis química de ARN en fase sólida , lo que permite la incorporación de una amplia variedad de nucleótidos modificados que no se encuentran naturalmente en el ARN. En conjunto, los resultados de estos experimentos presentan una imagen muy congruente del ciclo catalítico , es decir, cómo la ribozima en horquilla se une a su sustrato, se pliega en una estructura tridimensional específica, cataliza la reacción y libera el producto o productos de la reacción. [18]
Las ribozimas en horquilla se han modificado de tal manera que pueden usarse para apuntar a la escisión de otras moléculas de ARN. Esto es posible porque gran parte de la especificidad de sustrato de la ribozima en horquilla resulta del simple emparejamiento de bases de Watson-Crick dentro de las hélices 1 y 2. [19]
Un área de particular interés ha sido el desarrollo de ribozimas en horquilla para uso terapéutico potencial, por ejemplo, evitando la replicación de virus patógenos. Se han generado y expresado ribozimas en horquilla antivirales dentro de células de mamíferos, y se ha demostrado que las células que expresan diferentes ribozimas diseñadas son resistentes a la infección por VIH-1 , [20] [21] hepatitis B , [22] y virus Sindbis . [23]