La replicación por círculo rodante ( RCR ) es un proceso de replicación unidireccional de ácidos nucleicos que puede sintetizar rápidamente múltiples copias de moléculas circulares de ADN o ARN , como plásmidos , genomas de bacteriófagos y el genoma de ARN circular de viroides . Algunos virus eucariotas también replican su ADN o ARN a través del mecanismo de círculo rodante.
Como versión simplificada de la replicación por círculo rodante natural , se desarrolló una técnica de amplificación de ADN isotérmica, la amplificación por círculo rodante. El mecanismo RCA se utiliza ampliamente en biología molecular y nanotecnología biomédica , especialmente en el campo de la biodetección (como método de amplificación de señales). [1]
La replicación del ADN en círculo rodante se inicia mediante una proteína iniciadora codificada por el ADN del plásmido o bacteriófago, que corta una hebra de la molécula de ADN circular de doble cadena en un sitio llamado origen de doble cadena o DSO. La proteína iniciadora permanece unida al extremo fosfato 5' de la hebra cortada, y el extremo hidroxilo 3' libre se libera para servir como cebador para la síntesis de ADN por la ADN polimerasa III . Usando la hebra sin cortar como plantilla, la replicación procede alrededor de la molécula de ADN circular, desplazando la hebra cortada como ADN monocatenario. El desplazamiento de la hebra cortada lo lleva a cabo una helicasa codificada por el huésped llamada PcrA (la abreviatura de copia de plásmido reducida) en presencia de la proteína de iniciación de replicación del plásmido.
La síntesis continua de ADN puede producir múltiples copias lineales monocatenarias del ADN original en una serie continua de extremo a extremo denominada concatémero . Estas copias lineales se pueden convertir en moléculas circulares bicatenarias mediante el siguiente proceso:
En primer lugar, la proteína iniciadora hace otra muesca en el ADN para terminar la síntesis de la primera cadena (la principal). A continuación, la ARN polimerasa y la ADN polimerasa III replican el ADN de origen monocatenario (SSO) para formar otro círculo bicatenario. La ADN polimerasa I elimina el cebador, reemplazándolo por ADN, y la ADN ligasa une los extremos para formar otra molécula de ADN circular bicatenario.
A modo de resumen, una replicación típica de círculo rodante de ADN tiene cinco pasos: [2]
Algunos virus de ADN replican su información genómica en las células huésped mediante la replicación en círculo rodante. Por ejemplo, el virus del herpes humano-6 (HHV-6)(hibv) expresa un conjunto de "genes tempranos" que se cree que están involucrados en este proceso. [3] Los largos concatémeros resultantes son posteriormente escindidos entre las regiones pac-1 y pac-2 del genoma del HHV-6 por ribozimas cuando se empaqueta en viriones individuales. [4]
El virus del papiloma humano-16 (HPV-16) es otro virus que emplea la replicación continua para producir progenie a un ritmo elevado. El HPV-16 infecta las células epiteliales humanas y tiene un genoma circular de doble cadena. Durante la replicación, en el origen, el hexámero E1 se enrolla alrededor de la cadena simple de ADN y se mueve en la dirección 3' a 5'. En la replicación bidireccional normal, las dos proteínas de replicación se disocian en el momento de la colisión, pero en el HPV-16 se cree que el hexámero E1 no se disocia, lo que conduce a una replicación continua. Se cree que este mecanismo de replicación del HPV puede tener implicaciones fisiológicas en la integración del virus en el cromosoma del huésped y la eventual progresión al cáncer de cuello uterino. [5]
Además, el geminivirus también utiliza la replicación en círculo rodante como mecanismo de replicación. Es un virus responsable de la destrucción de muchos cultivos importantes, como la mandioca, el algodón, las legumbres, el maíz, el tomate y el quimbombó. El virus tiene un ADN circular, monocatenario, que se replica en las células de la planta huésped. Todo el proceso es iniciado por la proteína iniciadora de la replicación del geminivirus, Rep, que también es responsable de alterar el entorno del huésped para actuar como parte de la maquinaria de replicación. Rep también es sorprendentemente similar a la mayoría de las demás proteínas iniciadoras de la replicación rodante de las eubacterias, con la presencia de los motivos I, II y III en su extremo N. Durante la replicación en círculo rodante, el ssADN del geminivirus se convierte en dsADN y Rep se une al dsADN en la secuencia de origen TAATATTAC. Después de que Rep, junto con otras proteínas de replicación, se une al dsADN, forma un bucle de tallo donde el ADN se escinde en la secuencia del nanómero, lo que provoca un desplazamiento de la hebra. Este desplazamiento permite que la horquilla de replicación progrese en la dirección 3' a 5', lo que finalmente produce una nueva cadena de ADNss y una cadena de ADN concatemérica. [6]
Los intermediarios de replicación del ADN del bacteriófago T4 incluyen estructuras concateméricas circulares y ramificadas . [7] Estas estructuras probablemente reflejan un mecanismo de replicación de círculo rodante.
Algunos virus ARN y viroides también replican su genoma mediante la replicación del ARN en círculo rodante. En el caso de los viroides, existen dos vías alternativas de replicación del ARN que siguen respectivamente los miembros de la familia Pospiviroidae (replicación asimétrica) y Avsunviroidae (replicación simétrica).
En la familia Pospiviroidae (similar a PSTVd), la ARN polimerasa del huésped transcribe la cadena positiva circular del ARN en cadenas negativas oligoméricas y luego en cadenas positivas oligoméricas. [8] Estas cadenas positivas oligoméricas son escindidas por una ARNasa del huésped y ligadas por una ARN ligasa del huésped para reformar el ARN circular de cadena positiva monomérica. Esto se denomina vía asimétrica de replicación en círculo rodante. Los viroides de la familia Avsunviroidae (similar a ASBVd) replican su genoma a través de la vía simétrica de replicación en círculo rodante. [9] En esta vía simétrica, las cadenas negativas oligoméricas primero se escinden y ligan para formar cadenas negativas monoméricas, y luego se transcriben en cadenas positivas oligoméricas. Estas cadenas positivas oligoméricas luego se escinden y ligan para reformar la cadena positiva monomérica. La vía de replicación simétrica recibió ese nombre porque las cadenas positivas y negativas se producen de la misma manera.
La escisión de las cadenas oligoméricas más y menos está mediada por la estructura de ribozima de cabeza de martillo autoescindible presente en Avsunviroidae, pero dicha estructura está ausente en Pospiviroidae. [10]
La forma derivada de la replicación por círculo rodante se ha utilizado con éxito para la amplificación de ADN a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida. [1] Esta técnica de amplificación se denomina amplificación por círculo rodante (RCA). A diferencia de las técnicas de amplificación de ADN convencionales, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la RCA es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos isotérmica en la que la polimerasa añade continuamente nucleótidos individuales a un cebador hibridado con una plantilla circular, lo que da como resultado un ADN monocatemérico largo que contiene decenas a cientos de repeticiones en tándem (complementarias a la plantilla circular). [11]
Hay cinco componentes importantes necesarios para realizar una reacción RCA:
Las polimerasas utilizadas en la RCA son la ADN polimerasa Phi29 , Bst y Vent exo para la amplificación del ADN, y la ARN polimerasa T7 para la amplificación del ARN. Dado que la ADN polimerasa Phi29 tiene la mejor procesividad y capacidad de desplazamiento de cadena entre todas las polimerasas mencionadas anteriormente, se ha utilizado con mayor frecuencia en las reacciones de RCA. A diferencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la RCA se puede realizar a una temperatura constante (temperatura ambiente a 65 °C) tanto en solución libre como sobre objetivos inmovilizados (amplificación en fase sólida).
Normalmente hay tres pasos involucrados en una reacción RCA de ADN:
La RCA produce una amplificación lineal del ADN, ya que cada plantilla circular crece a una velocidad determinada durante un tiempo determinado. Para aumentar el rendimiento y lograr una amplificación exponencial como la PCR, se han investigado varios enfoques. Uno de ellos es la amplificación por círculo rodante hiperramificado o HRCA, en la que se añaden cebadores que se unen a los productos RCA originales y también se extienden. [12] De esta manera, el RCA original crea más plantillas que se pueden amplificar. Otra es la amplificación de círculo a círculo o C2CA, en la que los productos RCA se digieren con una enzima de restricción y se ligan a nuevas plantillas circulares utilizando un oligonucleótido de restricción, seguido de una nueva ronda de RCA con una mayor cantidad de plantillas circulares para la amplificación. [13]
La RCA puede amplificar un único evento de unión molecular más de mil veces, lo que la hace particularmente útil para detectar objetivos con una abundancia ultrabaja. Las reacciones de RCA se pueden realizar no solo en entornos de solución libre, sino también en una superficie sólida como vidrio, microesferas o nanoesferas, placas de micropocillos, dispositivos microfluídicos o incluso tiras de papel. Esta característica la convierte en una herramienta muy poderosa para amplificar señales en inmunoensayos en fase sólida (por ejemplo, ELISA ). De esta manera, la RCA se está convirtiendo en una herramienta de amplificación de señales muy versátil con amplias aplicaciones en genómica, proteómica, diagnóstico y biodetección.
La inmuno-RCA es un método de amplificación de señal isotérmica para la detección y cuantificación de proteínas con alta especificidad y alta sensibilidad. Esta técnica combina dos campos: la RCA, que permite la amplificación de nucleótidos, y el inmunoensayo, que utiliza anticuerpos específicos para biomarcadores intracelulares o libres. Como resultado, la inmuno-RCA proporciona una señal amplificada específica (alta relación señal-ruido), lo que la hace adecuada para detectar, cuantificar y visualizar marcadores proteicos de baja abundancia en inmunoensayos en fase líquida [14] [15] [16] e inmunohistoquímica .
La inmunorreacción RCA sigue una reacción inmunoadsorbente típica en tinción de tejido por ELISA o inmunohistoquímica. [17] Los anticuerpos de detección utilizados en la reacción inmunorreacción RCA se modifican uniendo un oligonucleótido de ssADN en el extremo de las cadenas pesadas. De esta forma, la sección Fab (fragmento de unión al antígeno) del anticuerpo de detección puede seguir uniéndose a antígenos específicos y el oligonucleótido puede servir como cebador de la reacción RCA.
El procedimiento típico de inmuno-RCA mediado por anticuerpos es el siguiente:
1. Un anticuerpo de detección reconoce un objetivo proteico específico. Este anticuerpo también está unido a un cebador de oligonucleótidos.
2. Cuando hay ADN circular, se une y el cebador coincide con la secuencia complementaria del ADN circular.
3. La secuencia complementaria de la plantilla de ADN circular se copia cientos de veces y permanece unida al anticuerpo.
4. La salida RCA (ssDNA alargado) se detecta con sondas fluorescentes utilizando un microscopio fluorescente o un lector de microplacas.
Además de la inmuno-RCA mediada por anticuerpos, el cebador RCA de ssDNA también se puede conjugar con el extremo 3' de un aptámero de ADN. La cola del cebador se puede amplificar mediante amplificación por círculo rodante. El producto se puede visualizar mediante el etiquetado de un marcador fluorescente. [19] El proceso se ilustra en la figura de la derecha.
Varios derivados de RCA se han utilizado ampliamente en el campo de la biodetección. Por ejemplo, RCA se ha utilizado con éxito para detectar la existencia de ADN viral y bacteriano en muestras clínicas, [20] [21] lo que resulta muy beneficioso para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas . También se ha utilizado como método de amplificación de señales en chip para ensayos de microarrays de ácidos nucleicos (tanto de ADN como de ARN) . [1]
Además de la función de amplificación en aplicaciones de biodetección, la técnica RCA se puede aplicar también a la construcción de nanoestructuras de ADN e hidrogeles de ADN. Los productos de RCA también se pueden utilizar como plantillas para el ensamblaje periódico de nanoespecies o proteínas, la síntesis de nanocables metálicos [22] y la formación de nanoislas. [1]