La esterasa de hemaglutinina ( HEs ) es una glicoproteína que poseen ciertos virus con envoltura y utilizan como mecanismo de invasión. La HEs ayuda a la unión y destrucción de ciertos receptores de ácido siálico que se encuentran en la superficie de la célula huésped . [1] Los virus que poseen HEs incluyen el virus de la influenza C , los torovirus y los coronavirus del subgénero Embecovirus (que no incluye los coronavirus similares al SARS ). La HEs es una proteína transmembrana dimérica que consta de dos monómeros, cada monómero está formado por tres dominios . Los tres dominios son: fusión de membrana , esterasa y dominios de unión al receptor .
Las diferentes actividades enzimáticas de las HE incluyen: actividad de unión al receptor, actividad de hidrólisis del receptor ( esterasa ) y actividad de fusión de membrana. La actividad de unión al receptor implica la unión de las HE al ácido N-acetil-9-O-acetilneuramínico (9-O-Ac-Neu5Ac) de los glicolípidos y las glicoproteínas y, a su vez, sirve como receptor viral. [2] La actividad de hidrólisis del receptor (esterasa) permite que las partículas del virus escapen de la célula infectada eliminando un grupo acetilo de la posición C9 de los residuos terminales 9-O-Ac-Neu5Ac. [2] La actividad de fusión de membrana ayuda a la incorporación del genoma viral al citoplasma de la célula huésped al mejorar la unión entre la envoltura viral y la membrana de la célula huésped .
En ciertos virus de la influenza , la superficie celular consta de proteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que abarcan actividades enzimáticas, mientras que se ha descubierto que las proteínas de fusión hemaglutinina-esterasa (HEF) son la proteína de pico única principal que combina todas las actividades enzimáticas enumeradas anteriormente. Se ha probado que las proteínas HEF son resistentes a altas temperaturas y pH bajo y son la principal fuente de virulencia en los virus. [3] Se ha demostrado que la influenza C tiene proteínas de estructura HEF únicas que mejoran su capacidad para infectar la célula huésped en comparación con la influenza A y B.
El plegamiento de los diferentes dominios de la proteína hemaglutinina-esterasa es importante para el transporte intracelular de proteínas desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi . La presencia de cadenas de oligosacáridos en los dominios E, F y R de la enzima HE también influye en el transporte intracelular. Se ha demostrado que la acilación de la hemaglutinina-esterasa desempeña un papel esencial en la replicación del ensamblaje de partículas virales. El proceso exacto de escisión catalítica enzimática aún no se ha detallado. Sin embargo, la escisión proteolítica debe ocurrir antes de la actividad de fusión de la membrana de la hemaglutinina-esterasa. Las proteínas HEF tienen una disposición hexagonal de espigas única. Esta característica es exclusiva de las partículas del virus de la influenza C. La disposición es una cubierta exterior de la partícula.
Ciertos estudios revelaron que el HE de los coronavirus y los torovirus se originó a partir de la glicoproteína HEF que se encuentra en los virus de la influenza C, que resultó de la alteración de la hemaglutinina esterasa de un trímero a un dímero de glicoproteína. [1] Durante este proceso, el dominio de la enzima destructora del receptor acetil esterasa se mantuvo sin cambios. Sin embargo, el dominio de unión al receptor HE se ha alterado en el que el ligando se une en orientación opuesta a la anterior. [1] Los monómeros HE de los coronavirus y los torovirus están formados por los mismos tres dominios: dominio central de esterasa/hidrolasa, dominio de lectina de unión al receptor y dominio proximal a la membrana que es pequeño. [4] Los dos monómeros del dímero HE tanto en CoV como en ToV involucran las mismas dos regiones de contacto (CR 1 y 2). CR 1 contiene el dominio de unión al receptor y la región de contacto 2 que contiene el dominio proximal a la membrana. Sin embargo, la región de contacto 2 de HE de ToV contiene un dominio de esterasa adicional. Como resultado, la superficie CR 2 es más grande en los HE de ToV que en los HE de CoV. Sin embargo, cerca del ancla de la membrana terminal carboxílica, hay una serie de puentes disulfuro entre Cys 385 del coronavirus HE que a su vez mantienen los dímeros HE conectados entre sí. [4]
En CoV HE, las dos láminas beta del dominio R están conectadas entre sí formando una lámina beta intermolecular continua a través de la interfaz del dímero. Por otro lado, en ToV están orientadas en ángulos. Como resultado, la lámina beta del dominio de unión al receptor en ToV está más retorcida, la región de contacto 1 es más pequeña y la posición de los dominios R se desplaza a lo largo de las cadenas Beta en comparación con CoV. [4]
"Los estudios iniciales realizados con microscopio electrónico demostraron que la espiga de HEF forma un trímero con forma de hongo que consiste en un tallo cerca de la membrana y una cabeza globular". [2]
Estudios posteriores pudieron examinar y mostrar una estructura de mayor resolución (4,5 Å) del trímero de fusión de la hemaglutinina esterasa utilizando cristalografía de rayos X del ectodominio escindido con bromelina . Tanto la hemaglutinina como la proteína de fusión de la hemaglutinina esterasa son similares en términos de estructura y plegamiento de segmentos individuales. Sin embargo, solo el 12% de los aminoácidos son idénticos entre HA y HEF. Una diferencia significativa entre HE y HEF es la presencia de una protuberancia adicional en el dominio globular de HEF (parte inferior del dominio) que contiene la región de la esterasa. La región de unión al receptor tanto en HA como en HEF se encuentra en la parte superior del dominio y contiene solo residuos HEF1. El tallo está formado por tres hélices α de 60 Å de largo que contienen: todas las secuencias de la secuencia HEF2 y ciertos residuos HEF1 que son residuos N-terminales (1–40) y residuos C-terminales (367–432). [2]
La estructura cristalina muestra que la forma en que el HEF se une al 9-O-Ac-Neu5Ac es la misma que la forma en que el HA se une al Neu5Ac. Las partes de unión incluyen una hélice α, un bucle y una cadena extendida. Hay enlaces de hidrógeno entre los aminoácidos (Tyr127, Thr170, Gly172, Tyr227 y Arg292) y los grupos hidroxilo del ligando, y otros residuos forman el soporte estructural del sitio de unión del receptor. Hay un bolsillo hidrofóbico único presente en el sitio de unión del HEF que a su vez aloja el grupo acetilmetilo. [2]
Los glicolípidos y las glicoproteínas contienen ácido N-acetil-9-O-acetilneuramínico (9-O-Ac-Neu5Ac), que actúa como receptor viral al que se une el HEF. El HEF puede unirse a su receptor independientemente de que el 9-O-Ac-Neu5Ac esté unido o no mediante un enlace α-2,3 o α-2,6 al siguiente residuo de galactosilo. Sin embargo, la especificidad del hospedador puede verse afectada por el ácido N-acetilneuramínico terminal (Neu5Ac) y el enlace glicosídico del Neu5Ac. El virus de la influenza C puede reconocer el 9-O-Ac-Neu5Ac en la superficie de diferentes células debido a su especificidad única por el receptor. [2]
La actividad hidrolasa del receptor de HEF ayuda a la liberación de partículas virales de una célula infectada utilizando la enzima esterasa que escinde el acetilo de la posición C9 del extremo 9-O-Ac-Neu5Ac. La actividad esterasa de HEF, que forma parte de la clase de las serina hidrolasas, incluye un ataque nucleofílico del grupo hidroxilo (OH) de un aminoácido serina, con la ayuda de otros dos aminoácidos (histidina y ácido aspártico), sobre el grupo carbonilo del sustrato. La histidina básica mejora la reactividad de la serina polarizando y desprotonando su grupo hidroxilo. Junto con eso, el ácido aspártico polariza la histidina. [2]
La cristalografía de rayos X de la estructura cristalina del HEF mostró que la serina 57, el ácido aspártico 352 y la histidina 355 son los aminoácidos importantes para la actividad esterasa. Además, los primeros estudios demostraron que la mutación en los residuos Ser57 e His355 puede detener por completo la actividad esterasa del HEF. [2]
La actividad de fusión de membranas entre la envoltura viral y las vesículas endocíticas de la célula huésped es importante para ayudar al virus a inyectar su genoma en el citoplasma de la célula. Para activar la fusión de membranas, es necesario escindir las proteínas precursoras HEF0 y HA0 en las subunidades HEF1 y HEF2 y luego exponerlas a un pH ácido. [2]
El pH ácido provoca la protonación de aminoácidos específicos que inician cierta reorganización de las proteínas. Se ha descubierto que el aminoácido protonado es la histidina, mientras que su pKa coincide con el pH del endosoma. Los estudios han demostrado que existe una diferencia de aproximadamente 0,7 en el valor de pH que desencadena la actividad de fusión de membranas entre cepas de influenza A y C. [2]
El cambio conformacional en la estructura del HEF que ocurre a un pH bajo da como resultado la separación del péptido de fusión de su ubicación en la parte inferior del tallo y la exposición de la superficie externa de la molécula, para que pueda insertarse en la membrana endosómica. Otro cambio conformacional ocurre que hace que la curvatura del ectodominio empuje al péptido de fusión hacia la región transmembrana. Como resultado de eso, las membranas del virus y del endosoma se acercan, intercambiando lípidos con hemifusión. Luego, se abre un poro de fusión y, finalmente, se completa la fusión de ambas bicapas lipídicas. [2]
El plegamiento de la proteína hemaglutinina esterasa y la forma en que se ensamblan los dominios de la proteína contribuyen al transporte de proteínas de membrana y secretoras desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi. Los investigadores descubrieron que la trimerización se produce en un punto antes de salir del RE. [5] Los monómeros de la proteína HE se pliegan antes de que sea posible el ensamblaje. Antes de que la hemaglutinina esterasa pueda informar al Golgi, debe estar ampliamente plegada y ensamblada.
La estructura de la hemaglutinina-esterasa contribuye al transporte intracelular. La glicoproteína hemaglutinina-esterasa (HE) del virus de la influenza C se compone de tres dominios: un dominio madre activo en la fusión de membranas (F), un dominio de acetilesterasa (E) y un dominio de unión al receptor (R). [6] La proteína contiene ocho sitios de glicosilación ligados a N, cuatro (posiciones 26, 395, 552 y 603) en el dominio F, tres (posiciones 61, 131 y 144) en el dominio E y uno (posición 189) en el dominio R. [6] Las cadenas de oligosacáridos en los dominios influyen en el transporte intracelular. Un estudio mostró que era evidente que la glicosilación en los dos sitios en el dominio F (posiciones 26 y 603), además de la del dominio E (posición 144), es necesaria para que la molécula de HE sea transportada desde el retículo endoplásmico y que las HE mutantes que carecen de uno de estos tres sitios no logran experimentar el ensamblaje del trímero. [6] Los oligosacáridos son necesarios para mantener la actividad de la esterasa en los dominios F y R. Si alguno de los dominios carece de una cadena de oligosacáridos, la expresión de la superficie celular se verá afectada. Se encontró que el monómero HE tiene actividad de acetilesterasa porque posee actividad enzimática completa a pesar de la falta de una cadena de oligosacáridos. [6] Las cadenas de oligosacáridos son importantes para el transporte intracelular, pero no para la actividad de fusión. Por lo tanto, las cadenas de oligosacáridos realmente no promueven la fusión de la membrana.
La acilación de la enzima hemaglutinina-esterasa es necesaria para la replicación del virus de la influenza C. Se encontró que el virus recombinante que carecía del sitio de acilación de HEF podía ser rescatado, pero los títulos virales se redujeron en un logaritmo en relación con el tipo salvaje de la influenza C. [2] Las partículas de virus resultantes tienen una composición proteica regular y no se observaron cambios en su morfología mediante microscopía electrónica, pero su actividad hemolítica se reduce, lo que indica un defecto en la fusión de la membrana. [2] Esto es en comparación con varios subtipos de proteína HA que mostraron resultados similares.
La proteína de fusión de hemaglutinina-esterasa presenta modificaciones co- y postraduccionales , como N-glicosilación, formación de enlaces disulfuro, S-acilación y escisión proteolítica en subunidades HEF1 y HEF2. [2] La proteína HEF del virus de la influenza C tiene solo un estearato unido a una cisteína transmembrana. Mientras que la HA de los virus de la influenza A y B se asocia con balsas de membrana, nanodominios enriquecidos con colesterol y esfingolípidos de la membrana plasmática, se cree que la HEF se localiza en la fase masiva de la membrana plasmática. [2]
Las propiedades de unión y escisión de la proteína hemaglutinina-esterasa (CHE) de los viriones de influenza C para los grupos 9- O -acetilo en los ácidos siálicos se han utilizado en varios ensayos utilizando viriones completos . [7]
La escisión proteolítica debe ocurrir antes de cualquier actividad de fusión de membrana de HE porque permite que la proteína se active a un pH bajo. Las proteínas HEF de todas las cepas del virus de la influenza C contienen un sitio de escisión monobásico y son en este sentido similares a las HA de los virus de influenza A humana, porcina, equina y aviar de baja patogenicidad. [2] Los sitios de escisión polibásicos que están presentes en la HA de los virus de influenza A aviar altamente patógenos y que son procesados por la proteasa ubicua furina no se encuentran en ninguna proteína HEF. En consecuencia, la replicación del virus de la influenza C se limita al sitio de infección del virus, el tracto respiratorio. [2] A diferencia de otros virus de la influenza, el virus de la influenza C no se propaga a otros tejidos. Los ciclos de replicación múltiples del virus de la influenza C en cultivos de tejidos se posibilitan mediante la adición de tripsina, mientras que los huevos embrionados producen virus infecciosos con HEF escindido. [2]
Hasta el momento no se ha identificado la enzima que cataliza la escisión proteolítica de HEF, pero dado que tanto HA como HEF pueden ser escindidos por tripsina en concentraciones similares in vitro (5~20 μg/mL), parece probable que también sean activados por las mismas enzimas dentro de las células. [2] Es muy común que HA se compare con HEF en muchos contextos.
La única proteína espiga del virus de la influenza C , la glicoproteína de fusión de hemaglutinina-esterasa (HEF), combina la unión al receptor, la hidrólisis del receptor y las actividades de fusión de membrana. [8] Al igual que otras glicoproteínas hemaglutinantes de los virus de la influenza, la HEF está S-acilada, pero solo con ácido esteárico en una única cisteína ubicada en el extremo que mira al citosol de la región transmembrana. [8] Sin embargo, esta proteína HE también tiene espigas en su organización estructural.
Los trímeros de HEF en las superficies de las partículas esféricas y filamentosas están dispuestos en una estructura reticular que se ha descrito que consiste principalmente en hexágonos. [2] Esta característica es exclusiva de las partículas del virus de la influenza C. Incluso cuando se elimina el HEF de la membrana, aún se puede ver la estructura reticular polimérica que tenía originalmente. Estos resultados indican que la disposición hexagonal es una característica intrínseca del HEF y no requiere otras proteínas virales como M1 y que su formación probablemente involucra interacción lateral entre los ectodominios del HEF. [2] La formación de la disposición de espiga en las partículas del virus actúa como una capa alrededor de la partícula del virus al crearla y cubrirla. Esto es similar al efecto hidrofóbico en las membranas de bicapa lipídica donde las moléculas no polares y en el interior.
Los sitios de N-glicosilación de HEF se encuentran en la figura 1. Un sequon se encuentra en HEF2 y seis en HEF1. Hay tres en la cabeza globular y 2 en la región de la bisagra que conecta el tallo con la cabeza. El sitio en la posición 589 no está glicosilado porque está demasiado cerca de la región que atraviesa la membrana y no puede ser accedido por la oligosacárido transferasa. La glicosilación es crucial para el plegamiento adecuado porque lo protege de la degradación proteolítica de la célula huésped y es importante para la presentación de epítopos antigénicos . [2]
La estructura primaria de HEF en la influenza C contiene 641 aminoácidos. Es una proteína transmembrana típica de tipo 1 con un péptido señal N-terminal corto, escindible, un ectodominio largo, una región transmembrana y una cola citoplasmática muy corta. HEF se compone de dos subunidades, HEF1 que consta del N-terminal y HEF2 que consta del dominio transmembrana y la cola citoplasmática. La microscopía electrónica que analiza la estructura cristalina de HEF mostró que la espiga de HEF forma un trímero con forma de hongo que consta de un tallo cerca de la membrana y una cabeza globular. HEF contiene solo carbohidratos unidos a asparagina , lo que indica que no ocurre O-glicosilación . La ubicación de los sitios de glicosilación individuales en la estructura cristalina se encuentra en siete de los ocho sequones de N-glicosilación altamente conservados ; uno se encuentra en la subunidad HEF2 y los otros seis se encuentran en la subunidad HEF1. Tres sitios están en la cabeza globular y dos están en la región de la bisagra que conecta el tallo con la cabeza. Hay un sitio en la posición 589 en la estructura cristalizada que no está glicosilado y esto puede deberse a la ubicación cercana a las regiones que atraviesan la membrana y no puede ser accedido por la oligosacárido transferasa. Las posiciones de HA en la influenza A son bastante similares a las de la influenza C, ya que la mayoría de sus posiciones de carbohidratos se encuentran en la subunidad más grande. [2]
En HEF1, 12/15 residuos de cisteína forman 6 enlaces disulfuro intracatenarios que estabilizan el dominio de la cabeza globular. Hay dos residuos de cisteína, Cys373 y Cys399, que no forman enlaces disulfuro en la proteína madura. Están ubicados en la bisagra que conecta la cabeza globular con la región del tallo. El resto de los residuos de cisteína forman enlaces disulfuro intercatenarios con HEF en el área del ectodominio, cerca de la parte inferior del trímero. Estos enlaces disulfuro en HEF2 permiten que la subunidad realice grandes cambios conformacionales que catalizan la fusión de membranas. [2]
En la influenza C, hay 15 residuos de cisteína en la subunidad HEF1, 12 de los residuos forman seis enlaces disulfuro intracatenarios que estabilizan el dominio de la cabeza globular. Dos de los residuos de cisteína no son necesarios para el plegamiento y la función adecuados de HEF y/o no forman un enlace disulfuro en la proteína madura ubicada en la bisagra de conexión. El resto de los residuos de cisteína forman un enlace disulfuro intercatenario con el único residuo de cisteína en el ectodominio de la subunidad HEF2. Este residuo se encuentra en la parte inferior del trímero. En comparación, la influenza A tiene distribuciones de enlaces disulfuro similares con un enlace que conecta HA1 con HA2, la mayoría son enlaces intracatenarios. La rara aparición de enlaces disulfuro en las subunidades HEF2 y HA2 permite que estas subunidades realicen grandes cambios conformacionales que catalizan la fusión de membranas. [2]
Durante la translocación de HEF hacia el lumen del RE, el péptido señal N-terminal se escinde y se unen los carbohidratos. Se forman y remodelan enlaces disulfuro. Estas modificaciones afectan el plegamiento y la trimerización de la molécula. Estos procesos son prerrequisitos para que la carga salga del RE. Más tarde, una cadena de ácidos grasos se une a la cisteína ubicada en el extremo de la región transmembrana y HEF se escinde en 2 subunidades; este proceso es esencial para la replicación del virus. [2]
En comparación, los virus de la influenza A, B y C tienen diferentes proteínas de la espícula: la hemaglutinina y la neuraminidasa. La glicoproteína de superficie HEF del virus de la influenza C consta de tres actividades: unión al receptor, inactivación del receptor y actividad de fusión. La unión al receptor media la unión del virus al ácido N-acetil-9-O-acetilneuramínico en la superficie celular, la inactivación del receptor libera el grupo 9-O-acetilo del ácido N-acetil-9-O-acetilneuramínico y la actividad de fusión depende de la escisión proteolítica postraduccional del HEF en dos subunidades, así como de la exposición a un entorno ácido. En condiciones de pH bajo, se produce un cambio conformacional del HEF. En el virus de la influenza A, la reorganización de las secuencias hidrofóbicas en el extremo N de la subunidad HEF2 queda expuesta e induce la fusión de la envoltura viral con la membrana de la célula diana. [9] Otra forma de fusionar la envoltura viral a la célula huésped es con vesículas endocíticas. El HEF no escinde el residuo terminal de ácido silícico de los carbohidratos, sino que elimina el grupo acetilo de la posición C9 del ácido N-acetil-9-O-acetilneuramínico. Esto es necesario para liberar partículas virales recién formadas de las células infectadas, que de otro modo quedarían atrapadas en la membrana plasmática si el receptor todavía está presente [2].
La influenza C se distingue de la influenza A y B por sus componentes estructurales. Hay tres aminoácidos que componen la porción citoplasmática del HEF, arginina-treonina-lisina, mientras que en la influenza A y B consta de diez aminoácidos de hemaglutinina. Una modificación postraduccional del HEF es la acilación con ácidos grasos. Se detectó que el ácido graso, ácido esteárico, era el ácido graso predominante unido al HEF, mientras que el ácido graso palmítico se encontró en todas las demás proteínas de membrana. [9] Debido a la frecuente redistribución de cepas, es monosubtípico y estable. Esto conduce a una nueva cepa que ayuda al virus a adaptarse mejor a su huésped. [2]