La fosforilasa quinasa (PhK) es una proteína quinasa específica de serina/treonina que activa la glucógeno fosforilasa para liberar glucosa-1-fosfato del glucógeno . La PhK fosforila la glucógeno fosforilasa en dos residuos de serina, lo que desencadena un cambio conformacional que favorece la forma "a" de la glucógeno fosforilasa, más activa, sobre la forma b, menos activa. [1]
La proteína es una holoenzima hexadecámera (es decir, un homotetrámero en el que cada subunidad es a su vez un tetrámero) dispuesta en forma de "mariposa". Cada una de las subunidades está compuesta por una subunidad α, β, γ y δ. La subunidad γ es el sitio de la actividad catalítica de la enzima, mientras que las otras tres subunidades cumplen funciones reguladoras.
Cuando no se modifican, las subunidades α y β inhiben la catálisis de la enzima, pero la fosforilación de ambas subunidades por la proteína quinasa A (PKA, o proteína quinasa dependiente de AMPc ) reduce sus respectivas actividades inhibidoras. La subunidad δ es la proteína eucariota ubicua calmodulina, que tiene 4 sitios de unión de iones de calcio. Cuando los niveles de Ca 2+ citosólico aumentan hasta 10 −7 M, la subunidad δ sufre un gran cambio conformacional que activa la actividad de la quinasa al unirse a un parche hidrofóbico complementario en la subunidad catalítica γ. [2]
La fosforilasa quinasa fue la primera proteína quinasa que se aisló y caracterizó en detalle, algo que Krebs, Graves y Fischer lograron por primera vez en la década de 1950. [3] [4] [5] En ese momento, la comunidad científica desconocía en gran medida la importancia de la fosforilación de proteínas en la regulación de los procesos celulares, y muchos en el campo descartaban las fosfoproteínas por considerarlas biológicamente poco importantes. Dado que la modificación covalente por fosforilación es un método importante y generalizado de regulación bioquímica en una amplia variedad de procesos celulares, el descubrimiento de esta reacción ha tenido un enorme impacto en la comprensión científica de los mecanismos reguladores.
El sustrato de la PhK, la glucógeno fosforilasa, había sido aislado por Carl y Gerty Cori en la década de 1930, quienes determinaron que había dos formas: una forma inactiva b y una forma activa a. Sin embargo, por razones desconocidas en ese momento, la única manera de aislar la glucógeno fosforilasa a del tejido muscular era mediante filtración con papel; otros métodos, como la centrifugación, no funcionarían. Fue una idea fundamental por parte de Fischer et al. que era la presencia de iones de calcio en el papel de filtro lo que generaba la isoforma activa "a". Investigaciones posteriores revelaron que los iones de calcio estaban de hecho activando la fosforilasa quinasa a través de la subunidad reguladora δ, lo que conduce a la fosforilación de la glucógeno fosforilasa. [6] [7] [8]
Los detalles precisos del mecanismo catalítico de PhK aún están bajo estudio. [9] [10] [11] [12] [13] Si bien esto puede parecer sorprendente dado que fue aislado hace más de 50 años, existen dificultades significativas para estudiar los detalles más finos de la estructura y el mecanismo de PhK debido a su gran tamaño y alto grado de complejidad. [2] En el sitio activo, existe una homología significativa entre PhK y otras denominadas proteínas quinasas de bucle P, como la proteína quinasa A (PKA, quinasa dependiente de AMPc). A diferencia de estas otras proteínas, que generalmente requieren la fosforilación de un residuo de serina o tirosina en el sitio catalítico para estar activas, la subunidad catalítica γ de PhK es constitutivamente activa debido a la presencia de un residuo de glutamato cargado negativamente, Glu-182. [11] [12]
Los datos estructurales y bioquímicos sugieren que un posible mecanismo de acción para la fosforilación de la glucógeno fosforilasa por PhK implica la transferencia directa de fosfato desde el trifosfato de adenosina (ATP) al sustrato serina . [9]
La fosforilasa quinasa es una holoenzima hexadecámera de 1,3 MDa, aunque su tamaño puede variar un poco debido a la sustitución de diferentes isoformas de subunidades a través del empalme del ARNm. [14] [15] [16] Consta de cuatro homotetrámeros, cada uno de los cuales comprende cuatro subunidades (α, β, δ, γ). Se sabe que solo la subunidad γ posee actividad catalítica, mientras que las otras cumplen funciones reguladoras. Debido a la inestabilidad de las subunidades reguladoras en solución, solo la subunidad γ se ha cristalizado individualmente:
En general, las subunidades están dispuestas en dos lóbulos orientados uno detrás del otro en lo que se ha descrito como una forma de "mariposa" con simetría D2. [14] [17] [18] Cada lóbulo consta de dos tetrámeros, cada uno de los cuales consta de las subunidades αβδγ como se describió anteriormente. La subunidad δ es indistinguible de la calmodulina celular , mientras que las subunidades α y β son homólogas cercanas entre sí y se propone que surgieron por duplicación de genes y diferenciación posterior. [19]
Fisiológicamente, la fosforilasa quinasa desempeña el importante papel de estimular la degradación del glucógeno en glucosa-1-fosfato libre mediante la fosforilación de la fosforilasa de glucógeno y la estabilización de su conformación activa. Esta actividad es particularmente importante en las células hepáticas y musculares, aunque con propósitos algo diferentes. Mientras que las células musculares generalmente degradan el glucógeno para impulsar su actividad inmediata, las células hepáticas son responsables de mantener la concentración de glucosa en el torrente sanguíneo. Por lo tanto, los mecanismos reguladores de la actividad de la fosforilasa de glucógeno varían un poco según el tipo de célula. [1]
En general, la enzima se regula alostéricamente y por fosforilación reversible. Las hormonas, los impulsos nerviosos y la contracción muscular estimulan la liberación de iones de calcio. Estos actúan como un activador alostérico , uniéndose a las subunidades δ de la fosforilasa quinasa y activando parcialmente la actividad enzimática. Esta unión estabiliza parcialmente la proteína en la forma activa. La fosforilasa quinasa se activa completamente cuando las subunidades β y α son fosforiladas por la proteína quinasa A y la subunidad delta se ha unido a los iones de calcio. [2] [7] [20]
En las células musculares, la fosforilación de las subunidades α y β por la PKA es el resultado de una cascada de señalización celular mediada por AMPc que se inicia con la unión de la epinefrina a los receptores β-adrenérgicos en la superficie celular. Además, la liberación de iones de calcio del retículo sarcoplásmico durante la contracción muscular inactiva la subunidad δ inhibidora y activa la PhK por completo.
En las células hepáticas, el proceso es algo más complejo. Tanto el glucagón como la epinefrina pueden desencadenar la cascada cAMP-PKA, mientras que la epinefrina también se une al receptor α-adrenérgico para desencadenar una cascada de fosfoinosítidos, lo que da como resultado la liberación de Ca 2+ del retículo endoplasmático .
Cuando la célula necesita detener la degradación del glucógeno, la PhK es desfosforilada por las proteínas fosfatasas 1 y 2, devolviendo las subunidades α y β a su configuración inhibitoria inicial. [21] [22]
Los defectos en los genes de la fosforilasa quinasa son la causa de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo IX (GSD tipo IX) y GSD tipo VI (anteriormente GSD tipo VIII ), que pueden afectar al hígado y/o los músculos. Entre estos defectos genéticos, algunos de los más comunes son las enfermedades de glucogenosis hepática ligada al cromosoma X (XLG), que se pueden subdividir en XLG I y XLG II. [23] [24] Clínicamente, estas enfermedades se manifiestan en un desarrollo corporal infantil lento y un agrandamiento anormal del hígado. En XLG I, la actividad de PhK se reduce anormalmente tanto en las células sanguíneas como en las células hepáticas, mientras que en XLG II la actividad enzimática disminuye solo en las células hepáticas. Ambas enfermedades se deben a mutaciones en el gen PHKA2, que codifica la subunidad α de la fosforilasa quinasa. En el caso de XLG I, las mutaciones son a menudo mutaciones sin sentido que dan lugar a subunidades α malformadas e inestables, mientras que las mutaciones en XLG II tienden a ser cambios sin sentido que alteran las subunidades de forma menos grave. Con base en datos bioinformáticos y estructurales, algunos han sugerido que las subunidades α y β pueden tener una actividad catalítica similar a las glicoamilasas, y que las mutaciones sin sentido en estas regiones de la subunidad α pueden contribuir a los síntomas de XLG II. [25] [26] Sin embargo, esta actividad catalítica propuesta aún debe probarse directamente.
