La evolución continua asistida por fagos ( PACE ) es una técnica basada en fagos para la evolución dirigida y automatizada de proteínas. Se basa en relacionar la actividad deseada de una proteína objetivo con la aptitud de un bacteriófago infeccioso que lleva el gen correspondiente de la proteína. Por lo tanto, las proteínas con mayor actividad deseada confieren mayor infectividad a su fago portador. Los fagos más infecciosos se propagan de manera más efectiva, seleccionando mutaciones ventajosas. La variación genética se genera utilizando polimerasas propensas a errores en los vectores fágicos y, con el tiempo, la proteína acumula mutaciones beneficiosas. Esta técnica es notable por realizar cientos de rondas de selección con una mínima intervención humana.
El componente central de PACE es un recipiente de volumen fijo conocido como la “laguna”. La laguna contiene vectores bacteriófagos M13 que llevan el gen de interés (conocido como plásmido de selección o SP), así como células hospedadoras de E. coli que permiten que el fago se replique. La laguna se diluye constantemente mediante la adición y el drenaje de medios líquidos que contienen células de E. coli . La velocidad de flujo del líquido se establece de manera que la velocidad de dilución sea más rápida que la velocidad de reproducción de E. coli , pero más lenta que la velocidad de reproducción del fago. Por lo tanto, un suministro fresco de células de E. coli está constantemente presente en la laguna, pero el fago solo se puede retener mediante una replicación suficientemente rápida. [1]
La replicación de fagos requiere la infección de E. coli , que, en el caso del fago M13, depende de la proteína III (pIII). [2] Cuando se utiliza PACE, los vectores de fagos carecen del gen para producir pIII. En cambio, la producción de pIII está vinculada a la actividad de la proteína de interés a través de un mecanismo que varía según el caso de uso, que a menudo implica un plásmido adicional que contiene el gen III que expresa pIII (gIII), conocido como plásmido accesorio o AP. En particular, la producción de fagos infecciosos aumenta con la producción de pIII. [3] Por lo tanto, cuanto mejor sea la actividad de la proteína, mayor será la tasa de producción de pIII y más fagos infecciosos se generarán para ese gen en particular.
Mediante el uso de polimerasas propensas a errores (codificadas en el plásmido de mutagénesis, o MP), se introduce variación genética en la porción del gen proteico de los vectores fágicos. Debido a las presiones selectivas aplicadas por el drenaje constante de la laguna, solo los fagos que pueden replicarse lo suficientemente rápido pueden retenerse en la laguna, por lo que con el tiempo se acumulan mutaciones beneficiosas en los fagos que se replican en la laguna. De esta manera, se realizan rondas de evolución continuamente, lo que permite que transcurran cientos de rondas con poca intervención humana. [1]
En el artículo inicial que fue pionero en esta técnica, se desarrollaron polimerasas de ARN T7 para reconocer diferentes promotores , como los promotores T3 o SP6. [4] Esto se hizo haciendo que el promotor objetivo fuera el único promotor para gIII. [5] Por lo tanto, las polimerasas mutantes con mayor especificidad para el promotor deseado causaron una mayor producción de pIII. Esto dio como resultado polimerasas con una actividad de ~3-4 órdenes de magnitud mayor para el promotor objetivo que el promotor T3 original. [4] Si bien este sistema PACE original solo realizaba una selección positiva, se desarrolló una variante que también permitía la selección negativa. Esto se hace vinculando la actividad no deseada a la producción de pIII no funcional, lo que disminuye la cantidad de fago infeccioso producido. [6]
Se han desarrollado proteasas para cortar diferentes péptidos utilizando PACE. En estos sistemas, el sitio de corte de la proteasa deseado se utiliza para unir una ARN polimerasa T7 y una lisozima T7 . La lisozima T7 evita que la polimerasa T7 transcriba gIII. Cuando se corta el enlace peptídico, se activa la polimerasa T7, lo que permite la transcripción del gen pIII. Este método se utilizó para crear una proteasa TEV con un sustrato peptídico significativamente diferente. [6] [7]
Utilizando PACE, se desarrollaron también aminoacil-ARNt sintetasas (aaRS) para aminoácidos no canónicos . La actividad de una aaRS está vinculada a la producción de pIII mediante la adición de un codón de terminación TAG en el medio de gIII. Las sintetasas que aminoacilan el ARNt supresor del codón TAG impiden la actividad del codón de terminación , lo que permite la producción de pIII funcional. Utilizando este sistema, se desarrollaron aaRS que utilizan aminoácidos no canónicos p -nitro-fenilalanina, yodofenilalanina y Boc-lisina. [8]
También se han desarrollado interacciones proteína-proteína utilizando PACE. Según este esquema, la proteína diana se fusiona con una proteína de unión al ADN, que se une a una secuencia diana situada aguas arriba del promotor gIII. La proteína en evolución se fusiona con una ARN polimerasa. Cuanto mejor sea la interacción proteína-proteína, más transcripción de pIII se produce, lo que permite la evolución de la interacción proteína-proteína en condiciones PACE. [6] Este método se utilizó para desarrollar variantes de endotoxina de Bacillus thuringiensis que pueden superar la resistencia a la toxina de los insectos. [6] [9]
PACE se utilizó para desarrollar APOBEC1 para una mayor expresión soluble. APOBEC1 es una citidina desaminasa que se ha utilizado en editores de bases para catalizar la edición de un solo nucleótido C-->T. [10] En E. coli , APOBEC1 generalmente se desprende de la solución en la fracción insoluble. [11] Para desarrollar APOBEC1 para una mejor expresión soluble, el extremo N de una polimerasa T7 se fusionó a APOBEC1, y la porción restante de la polimerasa se expresó por separado. La polimerasa T7 solo puede funcionar cuando la porción del extremo N puede unirse al resto de la polimerasa. Dado que APOBEC1 debe plegarse correctamente para que la porción del extremo N quede expuesta correctamente, la actividad de la polimerasa T7 se correlaciona con el plegamiento de APOBEC1. De la siguiente manera, la transcripción y producción de pIII está vinculada con la expresión soluble de APOBEC1 a través de la polimerasa T7. Usando este enfoque, la expresión soluble de APOBEC1 se incrementó 4 veces sin cambios en la función. [7] [9]
PACE también se utilizó para crear una desoxiadenosina desaminasa más activa catalíticamente. La desoxiadenosina desaminasa se utiliza en editores de bases para realizar la edición de un solo nucleótido A-->T. Esto se hizo colocando codones de terminación que contienen adenosina en el gen de la polimerasa T7. Si el editor de bases puede corregir el error, se produce una polimerasa T7 funcional, lo que permite la producción de pIII. Utilizando este sistema, desarrollaron una desoxiadenosina desaminasa con una actividad 590 veces mayor en comparación con el tipo salvaje. [12]
