La desamidación es una reacción química en la que se elimina un grupo funcional amida en la cadena lateral de los aminoácidos asparagina o glutamina o se convierte en otro grupo funcional. Normalmente, la asparagina se convierte en ácido aspártico o ácido isoaspártico . La glutamina se convierte en ácido glutámico o ácido piroglutámico (5-oxoprolina). En una proteína o péptido , estas reacciones son importantes porque pueden alterar su estructura, estabilidad o función y pueden conducir a la degradación de la proteína. El cambio químico neto es la adición de un grupo de agua y la eliminación de un grupo de amoníaco, que corresponde a un aumento de masa de +1 (0,98402) Da. Aunque la desamidación ocurre en la glutamina, la asparagina glicosilada y otras amidas, estas son insignificantes en condiciones típicas de proteólisis. [1]
En la desamidación de un residuo de asparagina en condiciones fisiológicas, la cadena lateral es atacada por el átomo de nitrógeno del siguiente grupo peptídico (en negro en la parte superior derecha de la Figura), formando un intermedio asimétrico de succinimida (en rojo). La asimetría del intermedio da como resultado dos productos de su hidrólisis, ya sea ácido aspártico (en negro a la izquierda) o ácido isoaspártico, que es un beta aminoácido (en verde en la parte inferior derecha). Sin embargo, existe la preocupación de que el ácido aspártico pueda isomerizarse después de la desamidación. [2] La desamidación de un residuo de glutamina puede proceder a través del mismo mecanismo pero a una velocidad mucho más lenta ya que la formación del intermedio de glutarimida de anillo de seis miembros es menos favorecida que la del intermedio de succinimida para la asparagina. En general, la desamidación puede eliminarse por proteólisis a un pH ácido o a un pH ligeramente básico (4,5 y 8,0, respectivamente) utilizando la endoproteasa, Glu-C. [2]
Las tasas de desamidación dependen de múltiples factores, entre ellos las secuencias primarias y las estructuras de orden superior de las proteínas, el pH, la temperatura y los componentes en las soluciones. La mayoría de los sitios de desamidación potenciales están estabilizados por una estructura de orden superior. Asn-Gly (NG), es el más flexible y, dado que es ácido, es el más propenso a la desamidación, con una vida media de alrededor de 24 h en condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 °C). [3]
Como aminoácido libre o como residuo N-terminal de un péptido o proteína, la glutamina se desamida fácilmente para formar ácido piroglutámico (5-oxoprolina). La reacción se produce mediante un ataque nucleofílico del grupo α-amino en la amida de la cadena lateral para formar una γ-lactama con la eliminación del amoníaco de la cadena lateral.
La desamidación de proteínas se ha analizado comúnmente mediante cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) a través del mapeo de péptidos. El nuevo método ERLIC-MS/MS informado recientemente mejoraría la separación de péptidos desamidados y no desamidados con una mayor identificación y cuantificación. [4]
La espectrometría de masas se utiliza habitualmente para caracterizar los estados de desamidación de las proteínas, incluidos los anticuerpos monoclonales terapéuticos. [5] La técnica es especialmente útil para el análisis de desamidación debido a su alta sensibilidad, velocidad y especificidad. Esto permite el análisis de desamidación en sitios específicos. [6]
Un desafío importante del uso de la espectrometría de masas es la formación de artefactos de desamidación durante la preparación de la muestra. Estos artefactos distorsionan significativamente los resultados porque sugieren mayores tasas de desamidación espontánea que las que se observan realmente. Esto puede resultar problemático en el caso de las proteínas terapéuticas, que pueden caracterizarse erróneamente en los protocolos de control de calidad si un gran porcentaje de la desamidación detectada se debe a artefactos. Estudios recientes indican que un pH más bajo puede reducir la tasa de artefactos de desamidación. [2]
Se ha conjeturado que las reacciones de desamidación son uno de los factores que limitan la vida útil de las proteínas. [1]
La desamidación se produce mucho más rápidamente si el aminoácido susceptible va seguido de un residuo pequeño y flexible, como la glicina , cuyo bajo impedimento estérico deja al grupo peptídico expuesto al ataque. Las reacciones de desamidación también se producen mucho más rápidamente a un pH (>10) y una temperatura elevados .
La endoproteasa Glu-C ha demostrado especificidad sólo para el ácido glutámico cuando se encuentra en condiciones de pH específicas (4,5 y 8,0) y escinde el lado C-terminal cuando se encuentra en una solución con Tris-HCl, bicarbonato o acetato.