La clasificación celular es el proceso mediante el cual se separa un tipo particular de célula de otras contenidas en una muestra en función de sus propiedades físicas o biológicas, como el tamaño, los parámetros morfológicos, la viabilidad y la expresión de proteínas tanto extracelulares como intracelulares. La población celular homogénea obtenida después de la clasificación se puede utilizar para una variedad de aplicaciones, incluidas la investigación, el diagnóstico y la terapia. [1]
Los métodos de clasificación celular se dividen en dos categorías principales: clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y clasificación celular inmunomagnética. [2] Sin embargo, debido a muchos años de refinamiento y a la mayor demanda de separación celular, los investigadores están trabajando para desarrollar dispositivos de clasificación microfluídica que tengan muchos beneficios en comparación con los principales tipos de clasificación celular activada por fluorescencia y métodos de clasificación celular inmunomagnética.
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La clasificación celular activada por fluorescencia también se conoce como clasificación celular por citometría de flujo o por el acrónimo FACS, que es una marca registrada de Becton Dickinson and Company . La clasificación celular activada por fluorescencia utiliza la citometría de flujo para separar las células en función de parámetros morfológicos y la expresión de múltiples proteínas extracelulares e intracelulares. Este método permite la clasificación celular multiparamétrica e implica encapsular las células en pequeñas gotas de líquido a las que se les dan cargas eléctricas selectivamente y se clasifican mediante un campo eléctrico externo. La clasificación celular activada por fluorescencia tiene varios sistemas que trabajan juntos para lograr una clasificación exitosa de eventos de interés. Estos incluyen sistemas fluídicos, ópticos y electrostáticos. El sistema fluídico tiene que establecer una ruptura sincronizada con precisión de la corriente de líquido en pequeñas gotas uniformes, de modo que las gotas que contienen células individuales puedan desviarse electrostáticamente [2]. Basado en la invención de Richard Sweet, [3] la formación de gotas del chorro de líquido de un clasificador celular se estabiliza mediante vibraciones de un transductor ultrasónico en la salida del orificio de la boquilla. Las perturbaciones crecen exponencialmente y conducen a la ruptura del chorro en gotitas con una sincronización precisa. Una célula de interés que debe clasificarse se mide en la zona de detección y se mueve por la corriente hasta el punto de ruptura. Durante la separación de la gotita con la célula en ella del chorro de líquido intacto, se aplica un pulso de voltaje al chorro de líquido para que las gotitas que contienen las células de interés puedan desviarse en un campo eléctrico entre dos placas deflectoras para su clasificación. Luego, las gotitas son atrapadas por tubos o recipientes de recolección colocados debajo de las placas deflectoras. [2] La clasificación de células por citometría de flujo produce una especificidad muy alta según uno o varios marcadores de superficie, pero una limitación está constituida por la cantidad de células que se pueden procesar durante una jornada laboral. Por esta razón, a menudo se considera el enriquecimiento previo de la población de interés mediante la clasificación de células inmunomagnéticas, especialmente cuando las células objetivo son comparativamente raras y se debe procesar un lote grande de células. Además, los clasificadores de células por citometría de flujo son instrumentos complejos que generalmente son utilizados únicamente por personal bien capacitado en instalaciones de citometría de flujo o laboratorios bien equipados y, dado que normalmente son de gran tamaño, no siempre es posible colocarlos dentro de una cabina de seguridad biológica.. Por lo tanto, no siempre es posible garantizar la esterilidad de la muestra y, dado que los sistemas fluídicos se pueden limpiar pero no son de un solo uso, existe la posibilidad de contaminación cruzada entre muestras. Otro aspecto a tener en cuenta es que la generación de gotitas dentro del instrumento podría dar lugar a formaciones de aerosoles que son peligrosas para el operador cuando se utilizan muestras infecciosas. Estas últimas consideraciones son de particular importancia cuando la clasificación celular se utiliza para aplicaciones clínicas (por ejemplo, terapia celular) y debe realizarse en condiciones de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF). Los investigadores pueden utilizar una variedad de tintes fluorescentes para diseñar paneles multicolor para lograr una clasificación simultánea y exitosa de múltiples tipos de células definidos con precisión. El diagrama A muestra la clasificación celular activada por fluorescencia de la selección celular negativa (grupo no deseado) y el diagrama B muestra FACS de la selección celular positiva (grupo deseado).
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Los colorantes fluorescentes pueden actuar de forma muy diferente. Por lo general, un colorante fluorescente se excitará con una fuente de luz (un láser) a una longitud de onda particular y emitirá luz a una energía más baja y una longitud de onda más larga. Los colorantes más comunes actúan uniéndose a los antígenos presentes en las células. Los antígenos comunes a los que se dirigen son los grupos de diferenciación (CD). [4] Estos son específicos de un cierto tipo de célula. Si puede identificar qué CD está presente en las células de su interés, entonces puede teñir su muestra con un colorante fluorescente específico para él y utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia para separar la población de interés. Sin embargo, existen muchos otros mecanismos por los que pueden actuar los colorantes fluorescentes.
Algunos colorantes pueden difundirse a través de las membranas. Aprovechando esta propiedad del colorante, los usuarios pueden caracterizar la actividad intracelular, así como la expresión superficial de las proteínas. Por ejemplo, en las células muertas, el yoduro de propidio (PI) puede penetrar el núcleo, donde se une al ADN. La señal fluorescente del PI se puede utilizar para cuantificar el contenido de ADN para el análisis del ciclo celular o para identificar células muertas en una muestra.
Se pueden utilizar ciertos colorantes fluorescentes para caracterizar la actividad intracelular cinética en lugar de fijar las células en formaldehído y perder células viables. La siguiente tabla describe los colorantes que se pueden utilizar para medir varios parámetros de citotoxicidad causados por el estrés oxidativo.
Esta configuración experimental es solo un ejemplo de las posibilidades de la citometría de flujo. En los sistemas FACS, estas células caracterizadas pueden clasificarse y purificarse para realizar experimentos posteriores.
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La clasificación celular inmunomagnética también se conoce como separación celular inmunomagnética, enriquecimiento celular inmunomagnético o clasificación celular activada magnéticamente, y comúnmente se conoce por el acrónimo MACS, que es una marca registrada de Miltenyi GmbH . La clasificación celular inmunomagnética se basa en la separación de perlas que pasan por un campo magnético. Una variedad de empresas ofrecen diferentes soluciones para el enriquecimiento o agotamiento de poblaciones celulares. La clasificación celular inmunomagnética proporciona un método para enriquecer una mezcla heterogénea de células en función de la expresión de proteínas de la superficie celular (antígenos). Esta tecnología se basa en la unión de pequeñas partículas inertes supramagnéticas a mAb específicos para antígenos en la población de células objetivo. Las células marcadas con estos conjugados de anticuerpo-perlas se separan a través de una columna que contiene una matriz ferromagnética. Al aplicar un campo magnético a la matriz, las perlas se adhieren a la matriz dentro de la columna y las células que las llevan no pueden pasar a través de ella. Las células no marcadas pueden atravesar la matriz y se recogen en el flujo continuo. Para eluir las células atrapadas de la columna, simplemente se elimina el campo magnético. Por lo tanto, la clasificación inmunomagnética de células permite diferentes estrategias para el enriquecimiento positivo o el agotamiento de células. [2] Las perlas inmunomagnéticas son pequeñas y, por lo general, no interfieren con los ensayos posteriores, sin embargo, para algunas aplicaciones puede ser necesario eliminarlas. El uso de este método de separación para aumentar el número de células no aumenta significativamente los tiempos de procesamiento, y la esterilidad de la muestra está garantizada si la clasificación celular se realiza dentro de una cabina de bioseguridad. Por otro lado, esta técnica permite que las células se separen basándose solo en un único marcador y no puede discriminar entre diferentes niveles de expresión de proteínas (análisis cuantitativo). La clasificación inmunomagnética de células ha demostrado ser beneficiosa cuando se utiliza con cultivos de células progenitoras neuronales (NPC) en particular, ya que es más fácil de manejar y causa un daño mínimo a las células vivas. [5]
Los cultivos de células madre neuronales son especialmente difíciles de trabajar porque las células cerebrales vivas son sensibles y tienden a contaminarse entre sí. [5] Para obtener resultados más claros, los laboratorios necesitan materiales más limpios, es decir, líneas de células madre neuronales más puras. [5] Un estudio realizado en 2019 (con el apoyo financiero de la New York Stem Cell Foundation y la Association for Frontotemporal Degeneration) descubrió que la clasificación celular inmunomagnética era una forma barata y sencilla de obtener dicha pureza con un daño mínimo a las líneas celulares, manteniendo así células de mejor calidad, recolectando células madre neuronales más homogéneas y aumentando sus posibilidades de encontrar tratamientos efectivos para trastornos neurológicos. [5] Utilizaron los métodos inmunomagnéticos y activados por fluorescencia para filtrar CD271 - (marcadores útiles para células madre mesenquimales ) y CD133 + (marcadores para células madre cancerosas) para comparar la viabilidad de cada método. [5]
La clasificación inmunomagnética de células también se ha utilizado en la asistencia a la reproducción (inseminación artificial) y en el tratamiento de trasplante de retina. [6] [7] En el caso de la reproducción asistida, se separan los espermatozoides apoptóticos (células muertas o dañadas) para que se puedan recolectar más espermatozoides no apoptóticos (no fragmentados) y utilizarlos para aumentar las posibilidades de fertilidad del sujeto. [6] Este tipo de tratamiento ha demostrado ser más eficaz cuando se realiza de forma repetida, aumentando la cantidad de células no apoptóticas presentes durante la inseminación. [6]
Un estudio de 2018 realizado en Francia (con el apoyo de varias personas y agencias, entre ellas: el Institut de la Vision en París y la Retina France Association) utilizó ratas y el método de clasificación celular inmunomagnética para demostrar que los fotorreceptores (células de la retina que responden a la luz) pueden trasplantarse para curar la ceguera. [7] En este proceso, las microperlas se unieron a la enzima CD73 para ayudar en la separación de los PR (fotorreceptores) de los organoides retinianos. [7] Cuando un antígeno CD73+ se expresó con células RCVRN+ (proteínas de unión al calcio en el ojo), mostró a los investigadores que esta combinación de CD73+ y RCVRN+ podría usarse con precursores de PR postmitóticos para la reparación. [7] Aunque el estudio no pudo verificar el éxito en humanos, tienen la base para futuras investigaciones basadas en el éxito de emparejar fotorreceptores no dañados con un antígeno CD73 y el trasplante en ratas. [7] Este éxito en la separación y el emparejamiento de células mediante trasplantes es prometedor para una posible cura de enfermedades de la retina, incluida la ceguera total. Hasta ahora, sólo se ha informado de una reparación parcial de la visión. [7]
Debido a las diversas limitaciones de los dispositivos de clasificación celular inmunomagnéticos y activados por fluorescencia, ha surgido una amplia gama de dispositivos de clasificación celular microfluídica. Algunos de ellos ya están disponibles comercialmente o en desarrollo comercial. Las investigaciones sobre diseños de clasificadores celulares microfluídicos a menudo emplean técnicas de litografía blanda que utilizan materiales como el polidimetilsiloxano (PDMS).
Un beneficio clave de los clasificadores microfluídicos es el potencial de realizar una clasificación celular activada por fluorescencia en un cartucho estéril cerrado de un solo uso. Un cartucho cerrado de este tipo evitaría la exposición de un operador a riesgos biológicos a través de las gotitas que emiten los sistemas FACS. Otros beneficios incluyen un impacto reducido en la viabilidad celular debido a la reducción del estrés hidrodinámico en las células. Algunos dispositivos publicados muestran el potencial de una clasificación multidireccional, una reducción del costo de un cartucho debido a los métodos de fabricación de bajo costo, un menor consumo de energía y huellas de menor tamaño, y algunos dispositivos son del tamaño de una tarjeta de crédito. Algunos han logrado resultados de alta pureza y tasas de hasta alrededor de 50.000 células/s. [8] [9] [10] [11]
Los separadores de células microfluídicos se pueden dividir en dos categorías: activos y pasivos. Los dispositivos activos desvían las células individuales mediante mediciones citométricas de las células, realizadas en tiempo real. Los dispositivos pasivos aprovechan las diferencias físicas entre las células en la forma en que interactúan con el flujo de fluido o las superficies.
Los separadores de células microfluídicos activos implican la desviación de células individuales después de su medición mediante métodos citométricos, que incluyen el marcado fluorescente, la dispersión de la luz y el análisis de imágenes. Las células individuales se desvían ya sea por una fuerza directa sobre la célula o una fuerza sobre el fluido que las rodea, de modo que fluyen hacia recipientes de salida separados.
Los métodos de deflexión celular emplean varios tipos de actuadores macroscópicos, ópticos o MEMS (sistemas microelectromecánicos) para desviar una partícula o un volumen de líquido dentro de un microcanal. Ejemplos recientes notables se basan en actuadores de ondas acústicas de superficie , [12] [13] [14] [15] [16] [17] actuadores macroscópicos (como actuadores piezoeléctricos) acoplados a microcanales, [18] [19] [20] [21] dielectroforesis de gotitas, [22] actuadores de burbujas de vapor térmico, [23] [24] [25] [26] [27] microvórtices transitorios generados por actuadores de burbujas de vapor térmico, [28] manipulación óptica, [29] y válvulas micromecánicas. Los más rápidos de estos han demostrado tasas de clasificación superiores a 1000/s y tasas de rendimiento máximo potencial en algunos casos que se acercan a las de FACS. [30] [31] [32] [33] [34] [35] La clasificación celular mediante microfluidos activos requiere una instrumentación de citometría similar a la clasificación celular activada por fluorescencia descrita anteriormente. [36]
Los clasificadores de células microfluídicos activos tienen el potencial de escalar el rendimiento mediante la paralelización en chip. [37] El dispositivo de clasificación microfluídica activa más rápido publicado ha demostrado un rendimiento de 160.000/s [38].
La clasificación pasiva de células utiliza el comportamiento del fluido dentro de los microcanales para alterar y separar las células en función del tamaño y la morfología. [39] El fluido en una solución coloidal está sujeto a un perfil de velocidad debido a las interacciones del fluido con las paredes del canal; las células en la solución están sujetas a varias fuerzas de arrastre e inercia que dependen del tamaño de la célula y se equilibran en consecuencia en diferentes ubicaciones a lo largo del perfil de velocidad. [40] En los canales microfluídicos curvos, se forman vórtices debido a la fuerza de Dean que ubica partículas de diferentes tamaños en diferentes ubicaciones de la sección transversal debido al número de Reynolds y al radio de curvatura de la curva. [41]
Por ejemplo, en un canal recto, las células más grandes en solución coloidal se encuentran más cerca del centro del microcanal que las células más pequeñas debido a las mayores fuerzas de arrastre de la pared que empujan a la célula lejos de la pared y la fuerza del gradiente de corte del perfil de velocidad que equilibra esta fuerza de arrastre de la pared para poner la célula en equilibrio. [42]
Antes de que la separación de células basada en fluorescencia e inmunomagnética ganara popularidad, se emplearon varios métodos de separación y enriquecimiento de células mediante anticuerpos. [43] Estos incluían la separación de células mediada por anticuerpos y complemento, dispositivos de inmunoafinidad de poliestireno y el sistema CellPro CEPRATE® SC que empleaba anticuerpos inmovilizados en una columna porosa. Este último fue el primer dispositivo médico aprobado por la FDA para la separación de células madre hematopoyéticas .
Una técnica de separación celular más reciente que emplea anticuerpos es la separación celular activada por flotabilidad (BACS), una técnica de separación en la que las microburbujas se unen a las células a través de anticuerpos que se unen a la superficie de las células. Las células seleccionadas se eliminan luego de una muestra biológica a través de flotación. [44]
La clasificación de células individuales proporciona un método para clasificar una mezcla heterogénea de células en función de sus propiedades intracelulares y extracelulares. Los métodos de clasificación de células individuales permiten comprender propiedades celulares que pueden estar ocultas o no ser evidentes. Existen varios métodos para clasificar células individuales:
La matriz microraft proporciona un método rápido y rentable para aislar células, analizar células a lo largo del tiempo y generar poblaciones clonales con la capacidad única de monitorear todas las propiedades intra y extracelulares. [45] Este sistema es ideal tanto para tipos de células adherentes como no adherentes.
Se estudió un método de una sola célula para observar la respuesta a un estímulo externo (en este caso, la respuesta celular a un ligando) utilizando un dispositivo microfluídico con válvulas de microcanales para atrapar una sola célula en una cámara. Se utilizó un sistema de 23 válvulas para la actuación y se utilizó un tinte fluorescente en la obtención de imágenes de estímulo-respuesta. [46]
Los métodos de agrupamiento de células individuales son una serie de métodos estadísticos diseñados por científicos de datos basados en propiedades intracelulares. El proceso incluye la recopilación de datos de ARN-Seq de células individuales; preprocesamiento de datos para agrupamiento; agrupamiento; y evaluaciones de agrupamiento. Los científicos aplican métodos de aprendizaje automático (principalmente análisis de agrupamiento) en los datos de ARN-Seq de células individuales para dividir las células en diferentes categorías. Todos los métodos se modifican para resolver los problemas en los datos de ARN-Seq, como la pérdida de genes de baja expresión y marcadores celulares ambiguos en presencia de sesgos técnicos. Los métodos de última generación incluyen SC3., [47] CIDR., [48] Seurat y para obtener información más detallada, consulte la página Wiki: Agrupamiento de ARN-Seq de células individuales.