La enzima citocromo c oxidasa o Complejo IV (antes EC 1.9.3.1, ahora reclasificada como translocasa EC 7.1.1.9) es un gran complejo proteico transmembrana que se encuentra en bacterias , arqueas y las mitocondrias de los eucariotas . [1]
Es la última enzima de la cadena de transporte electrónico respiratorio de las células situada en la membrana . Recibe un electrón de cada una de las cuatro moléculas de citocromo c y los transfiere a una molécula de oxígeno y cuatro protones , produciendo dos moléculas de agua. Además de unir los cuatro protones de la fase acuosa interna, transporta otros cuatro protones a través de la membrana, aumentando la diferencia transmembrana del potencial electroquímico protónico , que luego utiliza la ATP sintasa para sintetizar ATP .
El complejo es una gran proteína integral de membrana compuesta por varios sitios prostéticos metálicos y 14 [2] subunidades proteicas en mamíferos. En los mamíferos, once subunidades son de origen nuclear y tres se sintetizan en las mitocondrias. El complejo contiene dos hemo , un citocromo a y un citocromo a 3 , y dos centros de cobre, los centros Cu A y Cu B. [3] De hecho, el citocromo a 3 y el Cu B forman un centro binuclear que es el sitio de reducción de oxígeno. El citocromo c , que es reducido por el componente precedente de la cadena respiratoria (complejo citocromo bc1, complejo III), se acopla cerca del centro binuclear Cu A y le pasa un electrón, oxidándose de nuevo a citocromo c que contiene Fe 3+ . El centro binuclear Cu A reducido ahora pasa un electrón al citocromo a, que a su vez pasa un electrón al centro binuclear citocromo a 3 >-Cu B. Los dos iones metálicos en este centro binuclear están separados por 4,5 Å y coordinan un ion hidróxido en el estado completamente oxidado.
Los estudios cristalográficos de la citocromo c oxidasa muestran una modificación postraduccional inusual, que une el C6 de Tyr(244) y el ε-N de His(240) (numeración enzimática bovina). Desempeña un papel vital al permitir que el centro binuclear citocromo a 3 - Cu B acepte cuatro electrones para reducir el oxígeno molecular y cuatro protones para formar agua. Anteriormente se pensaba que el mecanismo de reducción implicaba un intermediario de peróxido , que se creía que conducía a la producción de superóxido . Sin embargo, el mecanismo actualmente aceptado implica una rápida reducción de cuatro electrones que implica la ruptura inmediata del enlace oxígeno-oxígeno, evitando cualquier intermediario que pueda formar superóxido. [4] : 865–866
El ensamblaje de COX en levaduras es un proceso complejo que no se comprende del todo debido a la rápida e irreversible agregación de subunidades hidrofóbicas que forman el complejo holoenzimático, así como a la agregación de subunidades mutantes con parches hidrofóbicos expuestos. [11] Las subunidades de COX están codificadas tanto en el genoma nuclear como en el mitocondrial. Las tres subunidades que forman el núcleo catalítico de COX están codificadas en el genoma mitocondrial. Para el ensamblaje de COX se requieren más de 30 proteínas chaperonas codificadas en el núcleo diferentes. [12]
Los cofactores, incluidos los hemo, se insertan en las subunidades I y II. Las dos moléculas de hemo residen en la subunidad I, ayudando con el transporte a la subunidad II, donde dos moléculas de cobre ayudan con la transferencia continua de electrones. [13] Las subunidades I y IV inician el ensamblaje. Diferentes subunidades pueden asociarse para formar intermediarios de subcomplejos que luego se unen a otras subunidades para formar el complejo COX. [11] En las modificaciones posteriores al ensamblaje, la COX formará un homodímero. Esto es necesario para la actividad. Los dímeros están conectados por una molécula de cardiolipina , [11] [14] [15] que se ha descubierto que desempeña un papel clave en la estabilización del complejo holoenzimático. La disociación de las subunidades VIIa y III junto con la eliminación de la cardiolipina da como resultado la pérdida total de la actividad enzimática. [15] Se sabe que las subunidades codificadas en el genoma nuclear desempeñan un papel en la dimerización y estabilidad de las enzimas. Las mutaciones en estas subunidades eliminan la función de la COX. [11]
Se sabe que el ensamblaje se produce en al menos tres pasos distintos que determinan la velocidad. Se han encontrado los productos de estos pasos, aunque no se han determinado las composiciones específicas de las subunidades. [11]
La síntesis y el ensamblaje de las subunidades I, II y III de COX se facilitan mediante activadores de la traducción, que interactúan con las regiones 5' no traducidas de las transcripciones de ARNm mitocondriales. Los activadores de la traducción están codificados en el núcleo. Pueden operar a través de la interacción directa o indirecta con otros componentes de la maquinaria de traducción, pero los mecanismos moleculares exactos no están claros debido a las dificultades asociadas con la síntesis de la maquinaria de traducción in vitro. [16] [17] Aunque las interacciones entre las subunidades I, II y III codificadas dentro del genoma mitocondrial hacen una contribución menor a la estabilidad de la enzima que las interacciones entre subunidades bigenómicas, estas subunidades están más conservadas, lo que indica posibles funciones inexploradas para la actividad enzimática. [18]
La reacción general es
Dos electrones pasan de dos citocromos c, a través de los sitios Cu A y citocromo a al centro binuclear citocromo a 3 –Cu B , reduciendo los metales a la forma Fe 2+ y Cu + . El ligando hidróxido se protona y se pierde como agua, creando un vacío entre los metales que se llena con O 2 . El oxígeno se reduce rápidamente, con dos electrones provenientes del Fe 2+ -citocromo a 3 , que se convierte a la forma ferril oxo (Fe 4+ =O). El átomo de oxígeno cercano a Cu B recoge un electrón de Cu + , y un segundo electrón y un protón del hidroxilo de Tyr(244), que se convierte en un radical tirosilo. El segundo oxígeno se convierte en un ion hidróxido al recoger dos electrones y un protón. Un tercer electrón de otro citocromo c pasa a través de los dos primeros transportadores de electrones al centro binuclear del citocromo a 3 –Cu B , y este electrón y dos protones convierten el radical tirosilo nuevamente en Tyr, y el hidróxido unido a Cu B 2+ en una molécula de agua. El cuarto electrón de otro citocromo c fluye a través de Cu A y citocromo a al centro binuclear del citocromo a 3 –Cu B , reduciendo el Fe 4+ =O a Fe 3+ , con el átomo de oxígeno recogiendo un protón simultáneamente, regenerando este oxígeno como un ion hidróxido coordinado en el medio del centro del citocromo a 3 –Cu B como estaba al comienzo de este ciclo. En total, se oxidan cuatro citocromos c reducidos mientras que O 2 y cuatro protones se reducen a dos moléculas de agua. [4] : 841–5
La COX existe en tres estados conformacionales: completamente oxidada (pulsada), parcialmente reducida y completamente reducida. Cada inhibidor tiene una alta afinidad por un estado diferente. En el estado pulsado, tanto el centro nuclear del hemo a 3 como el del Cu B están oxidados; esta es la conformación de la enzima que tiene la actividad más alta. Una reducción de dos electrones inicia un cambio conformacional que permite que el oxígeno se una en el sitio activo a la enzima parcialmente reducida. Cuatro electrones se unen a la COX para reducir completamente la enzima. Su estado completamente reducido, que consiste en un Fe 2+ reducido en el grupo hemo del citocromo a 3 y un centro binuclear Cu B + reducido , se considera el estado inactivo o de reposo de la enzima. [19]
El cianuro , la azida y el monóxido de carbono [20] se unen a la citocromo c oxidasa, inhibiendo el funcionamiento de la proteína y provocando la asfixia química de las células. Se necesitan concentraciones más altas de oxígeno molecular para compensar el aumento de las concentraciones del inhibidor, lo que conduce a una disminución general de la actividad metabólica en la célula en presencia de un inhibidor. Otros ligandos, como el óxido nítrico y el sulfuro de hidrógeno, también pueden inhibir la COX uniéndose a los sitios reguladores de la enzima, lo que reduce la tasa de respiración celular. [21]
El cianuro es un inhibidor no competitivo de la COX, [22] [23] uniéndose con alta afinidad al estado parcialmente reducido de la enzima y obstaculizando una mayor reducción de la enzima. En el estado pulsado, el cianuro se une lentamente, pero con alta afinidad. Se postula que el ligando estabiliza electrostáticamente ambos metales a la vez al posicionarse entre ellos. Una alta concentración de óxido nítrico, como la que se agrega exógenamente a la enzima, revierte la inhibición de la COX por el cianuro. [24]
El óxido nítrico puede unirse reversiblemente [25] a cualquiera de los iones metálicos en el centro binuclear para oxidarse a nitrito. El NO y el CN − competirán con el oxígeno para unirse en el sitio, reduciendo la tasa de respiración celular. Sin embargo, el NO endógeno, que se produce en niveles más bajos, aumenta la inhibición del CN − . Los niveles más altos de NO, que se correlacionan con la existencia de más enzima en el estado reducido, conducen a una mayor inhibición del cianuro. [19] En estas concentraciones basales, se sabe que la inhibición del complejo IV por NO tiene efectos beneficiosos, como el aumento de los niveles de oxígeno en los tejidos de los vasos sanguíneos. La incapacidad de la enzima para reducir el oxígeno a agua da como resultado una acumulación de oxígeno, que puede difundirse más profundamente en los tejidos circundantes. [25] La inhibición del complejo IV por NO tiene un efecto mayor en concentraciones de oxígeno más bajas, lo que aumenta su utilidad como vasodilatador en los tejidos que lo necesitan. [25]
El sulfuro de hidrógeno se unirá a la COX de manera no competitiva en un sitio regulador de la enzima, de manera similar al monóxido de carbono. El sulfuro tiene la mayor afinidad por los estados pulsados o parcialmente reducidos de la enzima, y es capaz de reducir parcialmente la enzima en el centro del hemo a 3. No está claro si los niveles endógenos de H2S son suficientes para inhibir la enzima. No hay interacción entre el sulfuro de hidrógeno y la conformación completamente reducida de la COX. [21]
El metanol presente en el alcohol desnaturalizado se convierte en ácido fórmico , que también inhibe el mismo sistema de oxidasa. Los niveles elevados de ATP pueden inhibir alostéricamente la citocromo c oxidasa, que se une desde el interior de la matriz mitocondrial. [26]
La citocromo c oxidasa tiene 3 subunidades que están codificadas por el ADN mitocondrial ( subunidad I , subunidad II y subunidad III de la citocromo c oxidasa ). De estas 3 subunidades codificadas por el ADN mitocondrial, dos se han identificado en localizaciones extramitocondriales. En el tejido acinar pancreático , estas subunidades se encontraron en gránulos de zimógeno . Además, en la hipófisis anterior , se encontraron cantidades relativamente altas de estas subunidades en gránulos secretores de la hormona del crecimiento . [27] La función extramitocondrial de estas subunidades de la citocromo c oxidasa aún no se ha caracterizado. Además de las subunidades de la citocromo c oxidasa, también se ha observado la localización extramitocondrial de un gran número de otras proteínas mitocondriales. [28] [29] Esto plantea la posibilidad de que existan mecanismos específicos aún no identificados para la translocación de proteínas desde las mitocondrias a otros destinos celulares. [27] [29] [30]
Los defectos que implican mutaciones genéticas que alteran la funcionalidad o la estructura de la citocromo c oxidasa (COX) pueden provocar trastornos metabólicos graves, a menudo fatales . Dichos trastornos suelen manifestarse en la primera infancia y afectan predominantemente a los tejidos con altas demandas energéticas (cerebro, corazón, músculo). Entre las muchas enfermedades mitocondriales clasificadas , se cree que las más graves son las que implican un ensamblaje disfuncional de la COX. [31]
La gran mayoría de los trastornos de la COX están relacionados con mutaciones en proteínas codificadas en el núcleo, denominadas factores de ensamblaje o proteínas de ensamblaje. Estos factores de ensamblaje contribuyen a la estructura y funcionalidad de la COX y están involucrados en varios procesos esenciales, entre ellos la transcripción y traducción de subunidades codificadas en la mitocondria, el procesamiento de preproteínas e inserción en la membrana y la biosíntesis e incorporación de cofactores. [32]
Actualmente, se han identificado mutaciones en siete factores de ensamblaje de COX: SURF1 , SCO1 , SCO2 , COX10 , COX15 , COX20 , COA5 y LRPPRC . Las mutaciones en estas proteínas pueden dar lugar a una alteración de la funcionalidad del ensamblaje de subcomplejos, el transporte de cobre o la regulación de la traducción. Cada mutación genética está asociada a la etiología de una enfermedad específica, y algunas tienen implicaciones en múltiples trastornos. Los trastornos que implican un ensamblaje disfuncional de COX a través de mutaciones genéticas incluyen el síndrome de Leigh , la miocardiopatía , la leucodistrofia , la anemia y la sordera neurosensorial .
La mayor dependencia de las neuronas de la fosforilación oxidativa para obtener energía [33] facilita el uso de la histoquímica de la COX para mapear el metabolismo cerebral regional en animales, ya que establece una correlación directa y positiva entre la actividad enzimática y la actividad neuronal. [34] Esto se puede ver en la correlación entre la cantidad y la actividad de la enzima COX, que indica la regulación de la COX a nivel de la expresión génica. La distribución de la COX es inconsistente en diferentes regiones del cerebro animal, pero su patrón de distribución es consistente en todos los animales. Este patrón se ha observado en el cerebro de mono, ratón y ternero. Una isoenzima de la COX se ha detectado de manera consistente en el análisis histoquímico del cerebro. [35] Tal mapeo cerebral se ha logrado en ratones mutantes espontáneos con enfermedad cerebelosa como el reeler [36] y un modelo transgénico de la enfermedad de Alzheimer . [37] Esta técnica también se ha utilizado para mapear la actividad de aprendizaje en el cerebro animal. [38]
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