En enzimología , una celobiosa deshidrogenasa (aceptor) ( EC 1.1.99.18) es una enzima que cataliza la reacción química.
Así, los dos sustratos de esta enzima son la celobiosa y el aceptor , mientras que sus dos productos son la celobiono-1,5-lactona y el aceptor reducido .
Esta enzima pertenece a la familia de las oxidorreductasas , en concreto las que actúan sobre el grupo CH-OH del donante con otros aceptores. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es celobiosa:aceptor 1-oxidorreductasa . Otros nombres de uso común incluyen celobiosa deshidrogenasa , celobiosa oxidorreductasa , Phanerochaete chrysosporium celobiosa oxidorreductasa , CBOR , celobiosa oxidasa , celobiosa:oxígeno 1-oxidorreductasa , CDH y celobiosa:(aceptor) 1-oxidorreductasa . A veces emplea un cofactor , FAD , pero en la mayoría de los casos tanto un hemo como un FAD ubicados en dominios separados. Produce la enzima de una de las oxidorreductasas extracelulares más complejas. Es producido por organismos que degradan la madera. [1]
Hasta la fecha, se informaron estructuras de los dominios separados de deshidrogenasa (DH) y citocromo (CYT) (códigos de acceso de PDB 1NAA [2] y 1PL3 [3] ). En 2015, se resolvieron las estructuras completas de la enzima para CDH de Crassicarpon hotsonii syn. Myriococcum thermophilum ( Ch CDH, código de acceso PDB 4QI6) y CDH de Neurospora crassa ( Nc CDH, código de acceso PDB 4QI7). [4]
La movilidad del dominio CYT impidió durante mucho tiempo la cristalización y la elucidación de la estructura por rayos X de CDH. Sin embargo, las estructuras cristalinas de los dominios individuales CYT [5] y DH [6] ya mostraron complementariedad estructural y la posición de la interfaz del dominio y proporcionaron una base estructural para la transferencia de electrones entre dominios observada en estudios bioquímicos y bioelectroquímicos. [7]
La estructura cristalina del dominio DH de Phanerochaete chrysosporium fue descrita por Hallberg et al. como maní con dimensiones de ~72 x 57 x 45 Å. El pliegue de la proteína GMC-oxidorreductasa observado presenta un subdominio de unión a FAD y un subdominio de unión a sustrato. El subdominio de unión a FAD consiste principalmente en el pliegue de Rossmann, que es típico de las enzimas dependientes de NAD(P) y FAD, mientras que el subdominio de unión a sustrato consiste en una hoja β central retorcida de siete hebras con tres hélices α en un lado de la hoja y el sitio activo en el otro lado. El subdominio de unión al sustrato alberga el sitio activo que consta de un sitio de unión al sustrato (sitio B) y el sitio catalítico (sitio C). El sitio B mantiene en posición el extremo no reductor de la celobiosa, mientras que en el sitio C oxida el extremo reductor de la celobiosa.
El dominio CYT consiste en un sándwich β antiparalelo elipsoidal con dimensiones de 30 x 36 x 47 Å y una topología que se asemeja a la cadena pesada variable del fragmento Fab del anticuerpo con una lámina β interna de cinco cadenas y una hoja β externa de seis cadenas. hoja . Este pliegue proteico fue un nuevo pliegue observado para un citocromo. Ambas estructuras cristalinas individuales proporcionaron conocimientos mecanicistas. El dominio DH se empapó con el inhibidor celobionolactam que resolvió la posición de unión del sustrato y dio una explicación mecanicista para la semirreacción reductora [52]. La estructura del dominio CYT reveló una coordinación inusual del hierro hemo b axial por un residuo His y Met, que es la base para la transferencia intramolecular de electrones entre los dos dominios. [8] Un estudio mutacional sobre los ligandos del hemo que coordinan el hierro realizado por Rotseart et al. [9] demostraron que la sustitución de Met por His o el cambio de ambos ligandos daba como resultado un dominio CYT inactivo de IET.
En 2015, la elucidación de las estructuras completas de CDH de Crassicarpon hotsonii (sin. Myriococcum thermophilum ) (PDB ID: 4QI6) y Neurospora crassa (PDB ID: 4QI7) aumentó la comprensión de la movilidad del dominio para el papel de CYT como mediador redox incorporado. Tan y Kracher et al. [10] demostró que la CDH existe en una conformación de estado cerrado y de estado abierto. En el estado cerrado, el hemo b acepta un electrón del FAD después de la oxidación del sustrato y lo dona a un aceptor de electrones externo en el estado abierto. Se descubrió que IET no depende del residuo Trp prominente ubicado directamente entre el FAD y el cofactor hemo, sino de una superficie expuesta Arg en el canal del sustrato, que estabiliza la interacción con CYT a través de un grupo propionato de hemo. El propionato-D del hemo b está plegado y un enlace de hidrógeno con Tyr99 en el dominio CYT le impide interactuar directamente con el sitio activo DH. La distancia más cercana de borde a borde entre el hemo by FAD es de 9 Å, que está dentro del límite de 14 Å para una transferencia eficiente de electrones. [11] El dominio CYT móvil de CDH es una característica única entre las GMC-oxidorreductasas y se adquiere en una etapa posterior de la evolución. [12] La movilidad del dominio CYT está regulada por un conector peptídico flexible de longitud y composición variables ( p. ej. , N. crassa CDH IIA = 17 aminoácidos, N. crassa CDH IIB = 33 aminoácidos), que conecta ambos dominios. El movimiento de CYT ha sido observado mediante estudios AFM [13] y SAXS [14] .
Las secuencias CDH evolucionaron en cuatro ramas filogenéticas: [15] Las secuencias CDH de Clase I se encuentran exclusivamente en Basidiomycota, mientras que las secuencias CDH de Clase II, Clase III y Clase IV se encuentran solo en Ascomycota. Las CDH de clase I tienen una fuerte afinidad por la celulosa y se unen presumiblemente a través de un sitio de unión de celulosa en la superficie del dominio DH [16] que es diferente del sitio activo. Este sitio de unión a celulosa no está presente en otras clases de CDH. La unión a la celulosa en las CDH de clase II depende de la presencia de un módulo de unión a carbohidratos de la familia 1 C-terminal (CBM1). Algunas CDH de Clase II presentan un CBM1 C-terminal y se clasifican como CDH de Clase IIA, mientras que las CDH de Clase IIB no tienen CBM1 y no se unen a la celulosa. Otras diferencias entre las CDH de Clase I y Clase II están en su especificidad de sustrato y el pH óptimo del IET. Poco se puede decir sobre las CDH de clase III y IV, que aún no se han expresado ni caracterizado. A partir de los alineamientos de secuencias se puede deducir una geometría diferente del sitio activo, pero se desconoce el sustrato. Las CDH de clase IV están más relacionadas evolutivamente con las otras clases de CDH y no presentan un dominio CYT de transferencia de electrones, lo que sugiere un papel fisiológico diferente y la pérdida de su capacidad para DET.
CDH cataliza la oxidación 2e-/2H+ del átomo de carbono anomérico (C1) del disacárido celobiosa a celobiono-δ-lactona y luego se hidroliza a ácido celobiónico en agua. Además del sustrato natural celobiosa y las celodextrinas celotriosa, celotetraosa, celopentaosa y celohexaosa, también la unidad formadora de celulosa glucosa, así como los monómeros formadores de hemicelulosa o productos de degradación galactosa, manosa, manobiosa, manopentaosa, xilosa, xilobiosa y xilotriosa, o derivados del almidón. Se ha informado que la maltosa, la maltotriosa y la maltotetraosa son sustratos de eficacia catalítica muy variable para la CDH. [17] Un muy buen sustrato no relacionado con los polisacáridos vegetales es la lactosa, debido a su similitud estructural con la celobiosa. La celobiosa, los celooligosacáridos y la lactosa son los sustratos para los cuales la CDH muestra la mayor eficiencia catalítica, mientras que los monosacáridos son malos sustratos con una afinidad muy baja (alta KM ) solo por el sitio C catalítico de la CDH. La extrema discrepancia de las eficiencias catalíticas de P. chrysosporium CDH para la celobiosa sobre la glucosa (87500: 1) se está conectando con el papel fisiológico de la enzima basidiomiceto de la pudrición blanca. [18] En los CDH de ascomicetos, la discriminación de la glucosa es menos estricta [19] y se convierte un espectro más amplio de mono y oligosacáridos. Por supuesto, la afinidad de la CDH por los sustratos de di y oligosacáridos es mucho mayor que la de los monosacáridos. Sin embargo, las CDH de clase II tienen valores de KM para glucosa de 10 a 100 mM, que se encuentran en el rango de la glucosa oxidasa dependiente de FAD, también una GMC-oxidorreductasa (5 a 100 mM). La menor tasa catalítica de las CDH de Clase I y Clase II (por debajo de 50 s −1 ) en comparación con la glucosa oxidasa (300–2000 s −1 ) es probablemente una adaptación evolutiva al dominio CYT adquirido para optimizar el IET y prevenir reacciones inútiles del sustrato. en un sitio activo inactivo.
CDH exhibe varias propiedades que lo convierten en un electrocatalizador adecuado para biosensores o células de biocombustible. [20] A diferencia de cualquier otra GMC-oxidorreductasa convertidora de carbohidratos, se puede contactar mediante transferencia de electrones mediada (MET) o transferencia directa de electrones (DET). Se han desarrollado biosensores de segunda y tercera generación basados en CDH para la cuantificación de moléculas comercial o médicamente relevantes, como la glucosa o la lactosa. La ventaja de los biosensores de segunda generación es su alta sensibilidad, la ventaja de los biosensores de tercera generación es que evitan los mediadores redox en los sistemas implantables de monitorización de glucosa en sangre. Los biosensores de tercera generación basados en CDH tienen un rendimiento sólido debido a la buena estabilidad térmica y de rotación de CDH y el dominio CYT móvil, que puede interactuar con muchos materiales de electrodos y modificaciones de superficie y entregar densidades de corriente razonablemente altas.
CDH se ha utilizado como elemento biosensor para la detección de diversos analitos desde 1992, cuando Elmgren et al. informaron sobre un nuevo biosensor sensible a celooligosacáridos con grados de polimerización de 2 a 6, lactosa y maltosa. [21] Se han revisado las investigaciones sobre CDH empleada como biosensor desde entonces hasta 2013, [22] proporcionando listas de biosensores basados en CDH en modo DET y MET para fenoles (catecol, dopamina, noradrenalina, hidroquinona, aminofenol) y carbohidratos (celobiosa). , lactosa, maltosa, glucosa).
Tanto los CDH de Clase I como los de Clase II se han empleado como biocatalizadores para biosensores. De acuerdo con sus sustratos preferidos, los CDH de Clase I se aplicaron principalmente para la detección y cuantificación de fenoles, celobiosa y lactosa, mientras que los CDH de Clase II se aplicaron para la detección de celobiosa, lactosa, maltosa y glucosa. Entre las CDH de Clase I, Phanerochaete chrysosporium CDH es la enzima más estudiada y se empleó para la detección de diversos derivados de fenol, celobiosa y lactosa. Se han utilizado Phanerochaete sordida y Trametes villosa CDH para la detección de lactosa y Sclerotium rolfsii CDH para la detección de dopamina.
Entre las CDH de Clase II, se emplearon Crassicarpon hotsonii y Crassicarpon thermophilum CDH como elemento de reconocimiento para celobiosa, lactosa, glucosa y maltosa y Humicola insolens CDH para glucosa y maltosa. En todos los casos, la detección de maltosa solo se informó para mostrar que la maltosa no interfiere con la detección de glucosa, que es importante para las pruebas de glucosa en sangre. [23]
En 2017, DirectSens GmbH lanzó el primer biosensor de lactosa basado en un CDH para concentraciones muy bajas de lactosa en productos lácteos reducidos en lactosa. LactoSens es el único biosensor de tercera generación disponible en el mercado y distribuido globalmente a empresas lácteas.
