La amplificación por polimerasa recombinasa (RPA) es una alternativa isotérmica de un solo tubo a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [1] Al agregar una enzima transcriptasa inversa a una reacción de RPA, puede detectar ARN y ADN , sin la necesidad de un paso separado para producir ADNc . [2] [3] [4] Debido a que es isotérmica , la RPA puede utilizar equipos mucho más simples que la PCR, que requiere un ciclador térmico . Al funcionar mejor a temperaturas de 37 a 42 °C y seguir funcionando, aunque más lentamente, a temperatura ambiente, significa que, en teoría, las reacciones de RPA se pueden ejecutar rápidamente simplemente sosteniendo un tubo en la mano. Esto hace que la RPA sea un excelente candidato para desarrollar pruebas moleculares rápidas y de bajo costo en el punto de atención. Una evaluación de calidad internacional de la detección molecular del virus de la fiebre del Valle del Rift tuvo un desempeño tan bueno como las mejores pruebas de RT-PCR, detectando muestras menos concentradas que no detectaron algunas pruebas de PCR y una prueba RT-LAMP . [5] RPA fue desarrollado y lanzado por TwistDx Ltd. (antes conocida como ASM Scientific Ltd), una empresa de biotecnología con sede en Cambridge, Reino Unido.
El proceso RPA emplea tres enzimas principales : una recombinasa , una proteína de unión al ADN monocatenario (SSB) y una polimerasa de desplazamiento de cadena .
Las recombinasas son capaces de emparejar cebadores de oligonucleótidos con secuencias homólogas en ADN dúplex. [1]
Los SSB se unen a las cadenas de ADN desplazadas y evitan que los cebadores se desplacen.
Finalmente, la polimerasa que desplaza la hebra comienza la síntesis de ADN donde el cebador se ha unido al ADN objetivo.
Al utilizar dos cebadores opuestos, de forma muy similar a la PCR, si la secuencia diana está realmente presente, se inicia una reacción de amplificación exponencial del ADN . No se requiere ninguna otra manipulación de la muestra, como fusión térmica o química, para iniciar la amplificación. A temperaturas óptimas (37–42 °C), la reacción progresa rápidamente y da como resultado una amplificación específica del ADN desde solo unas pocas copias diana hasta niveles detectables, generalmente en 10 minutos, para la detección rápida de ADN o ARN genómico viral, [2] [3] [4] [6] [7] [8] ADN genómico bacteriano patógeno, [9] [10] así como ADN aptámero de longitud corta. [11]
Las tres enzimas principales de RPA se pueden complementar con otras enzimas para proporcionar una funcionalidad adicional. La adición de la exonucleasa III permite el uso de una sonda exo para la detección de fluorescencia en tiempo real similar a la PCR en tiempo real. [1] La adición de la endonucleasa IV significa que se puede utilizar una sonda nfo para la detección de la amplificación exitosa mediante tiras de flujo lateral . [1] [6] [12] Si se agrega una transcriptasa inversa que funciona a 37-42 °C, se puede realizar la transcripción inversa del ARN y amplificar el ADNc producido, todo en un solo paso. Actualmente, solo está disponible la versión TwistAmp exo de RPA con la transcriptasa inversa incluida, aunque los usuarios pueden simplemente complementar otras reacciones de TwistAmp con una transcriptasa inversa para producir el mismo efecto. Al igual que con la PCR, todas las formas de reacciones de RPA se pueden multiplexar mediante la adición de pares de cebadores/sonda adicionales, lo que permite la detección de múltiples analitos o un control interno en el mismo tubo.
La RPA es una de las diversas técnicas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que se han desarrollado como técnica de diagnóstico molecular, frecuentemente con el objetivo de simplificar la instrumentación de laboratorio requerida en relación con la PCR . Una lista parcial de otras técnicas de amplificación isotérmica incluyen LAMP , NASBA , amplificación dependiente de helicasa (HDA) y reacción de amplificación de enzimas de mellado (NEAR). Las técnicas difieren en los detalles del diseño del cebador y el mecanismo de reacción, y en algunos casos (como la RPA) hacen uso de cócteles de dos o más enzimas. Al igual que la RPA, muchas de estas técnicas ofrecen tiempos de amplificación rápidos con el potencial de una instrumentación simplificada y una resistencia reportada a sustancias en muestras no purificadas que se sabe que inhiben la PCR. Con respecto al tiempo de amplificación, los termocicladores modernos con rampas de temperatura rápidas pueden reducir los tiempos de amplificación de PCR a menos de 30 minutos, particularmente para amplicones cortos que utilizan ciclos de doble temperatura en lugar de los protocolos convencionales de tres temperaturas. [13] Además, las exigencias de preparación de la muestra (incluida la lisis y extracción de ADN o ARN, si es necesario) deben considerarse como parte del tiempo total y la complejidad inherentes a la técnica. Estos requisitos varían según la técnica, así como también según el objetivo específico y el tipo de muestra.
En comparación con la PCR, las pautas para el diseño de cebadores y sondas para RPA están menos establecidas y pueden requerir un cierto grado de prueba y error, aunque los resultados recientes indican que los cebadores de PCR estándar también pueden funcionar. [14] El principio general de un amplicón discreto delimitado por un cebador directo e inverso con una sonda fluorogénica interna (opcional) es similar a la PCR. Los cebadores de PCR se pueden utilizar directamente en RPA, pero su corta longitud significa que las tasas de recombinación son bajas y la RPA no será especialmente sensible o rápida. Por lo general, se necesitan cebadores de 30 a 38 bases para la formación eficiente del filamento de recombinasa y el rendimiento de la RPA. Esto contrasta con algunas otras técnicas como LAMP que utilizan una mayor cantidad de cebadores sujetos a restricciones de diseño adicionales. Aunque el informe original de 2006 de RPA describe un conjunto funcional de componentes de reacción, la formulación actual (propietaria) del kit TwistAmp es "sustancialmente diferente" [15] y solo está disponible a través del proveedor TwistDx. Esto se compara con las mezclas de reacción para PCR que están disponibles de muchos proveedores, o LAMP o NASBA, para los cuales la composición de la mezcla de reacción se publica libremente, lo que permite a los investigadores crear sus propios "kits" personalizados a partir de ingredientes económicos.
En general, la literatura científica publicada carece de comparaciones detalladas del desempeño de las técnicas de amplificación isotérmica, como RPA, HDA y LAMP, entre sí; a menudo, se compara una sola técnica isotérmica con un ensayo de PCR de "estándar de oro". Esto dificulta juzgar los méritos de estas técnicas independientemente de las afirmaciones de los fabricantes, inventores o defensores. Además, las características de desempeño de cualquier técnica de amplificación son difíciles de disociar del diseño del cebador: un conjunto de cebadores "bueno" para un objetivo para RPA puede dar una amplificación más rápida o una detección más sensible que un conjunto de cebadores LAMP "malo" para el mismo objetivo, pero lo inverso puede ser cierto para diferentes conjuntos de cebadores para un objetivo diferente. Una excepción es un estudio reciente que compara RT-qPCR, RT-LAMP y RPA para la detección del virus de Schmallenberg y el virus de la diarrea viral bovina, [16] que efectivamente señala que cada técnica de amplificación tiene fortalezas y debilidades, que pueden variar según el objetivo, y que las propiedades de las técnicas de amplificación disponibles deben evaluarse en combinación con los requisitos para cada aplicación. Al igual que con la PCR y cualquier otra técnica de amplificación, es evidente que existe un sesgo de publicación y que los conjuntos de cebadores de bajo rendimiento rara vez se consideran dignos de ser informados.