La α-amanitina ( alfa -amanitina ) es un péptido cíclico de ocho aminoácidos . Es posiblemente la más mortal de todas las amatoxinas , toxinas que se encuentran en varias especies del género de hongos Amanita , una de ellas es la Amanita phalloides , así como el ángel destructor , un complejo de especies similares, principalmente A. virosa y A. bisporigera . También se encuentra en los hongos Galerina marginata , Lepiota subincarnata y Conocybe filaris . La DL50 oral de la amanitina es de 100 μg/kg para ratas.
A diferencia de la mayoría de los péptidos cíclicos , las amatoxinas (y las falotoxinas ) se sintetizan en los ribosomas . Los genes que codifican la proproteína de la α-amanitina pertenecen a la misma familia que los que codifican la falacidina (una falotoxina ). [1]
La α-amanitina es un inhibidor selectivo de la ARN polimerasa II y III , pero no de la I. [2] [3] Este mecanismo la convierte en una toxina mortal.
La α-amanitina también se puede utilizar para determinar qué tipos de ARN polimerasa están presentes. Esto se hace probando la sensibilidad de la polimerasa en presencia de α-amanitina. La ARN polimerasa I es insensible, la ARN polimerasa II es altamente sensible (inhibida a 1 μg/ml), la ARN polimerasa III es moderadamente sensible (inhibida a 10 μg/ml) y la ARN polimerasa IV es ligeramente sensible (inhibida a 50 μg/ml). [ cita requerida ] [4] [5]
La α-amanitina es un octapéptido bicíclico altamente modificado que consta de un bucle externo y uno interno. El bucle externo está formado por enlaces peptídicos entre un extremo carboxilo terminal de un aminoácido y el extremo amino terminal posterior del siguiente residuo. El bucle interno está cerrado por un enlace triptationina entre 6-hidroxi- triptófano y cisteína . Además, la α-amanitina está decorada con cadenas laterales de aminoácidos modificadas (2 S ,3 R ,4 R )-4,5-dihidroxi- isoleucina , trans -4-hidroxi- prolina , lo que le da su alta afinidad por la ARN polimerasa II y III . [6]
Los primeros métodos para detectar la alfa-amanitina incluían la cromatografía en capa fina (TLC). En la mayoría de los sistemas de disolventes utilizados en la TLC, la alfa-amanitina y la beta-amanitina viajaban a velocidades diferentes, lo que permitía la identificación individual de cada toxina. Otro método temprano fue la prueba de Meixner (también conocida como prueba de Wieland), que detectaba amatoxinas, pero también arrojaba falsos positivos para algunos compuestos, como la psilocina . [7] También se desarrolló la electroforesis capilar en zona , pero no era lo suficientemente sensible para las muestras clínicas, pero sí lo suficiente para los extractos de hongos. [8]
Más recientemente, el uso de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se ha convertido en el método preferido, que permite una mejor resolución, reproducibilidad y mayor sensibilidad. [9] Se puede combinar una variedad de detectores con HPLC, como espectrometría UV o de masas .
Ya en la década de 1980 se desarrollaron ensayos basados en anticuerpos ( inmunoensayos ) para la amanitina (pero con mayor frecuencia reconocen amatoxinas ya que los anticuerpos reaccionan de forma cruzada con algunos de los congéneres ). Los primeros inmunoensayos fueron los radioinmunoensayos y luego los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas ( ELISA ). Más recientemente, en 2020, se desarrolló un inmunoensayo de flujo lateral basado en anticuerpos monoclonales (similar a una prueba de embarazo) que puede detectar de forma rápida y selectiva amatoxinas en hongos [10] y en muestras de orina. [11]
Matinkhoo et al. idearon estrategias para superar tres obstáculos sintéticos para dar α-amanitina en 2018. [12] Primero, la síntesis enantioselectiva de la síntesis de péptidos en fase sólida compatible (2 S ,3 R ,4 R )-4,5-dihidroxiisoleucina se proporcionó en 11 pasos a partir de 2-(benciloxi)acetaldehído. Dos pasos clave que definen la estereoquímica incluyen la crotilación de Brown en las posiciones ( 3R , 4R ) y la síntesis asimétrica de aminoácidos de Strecker en el carbono ( 2S ) -α . [13] En segundo lugar, el cierre quimioselectivo del anillo interno por fluorociclación entre 6-hidroxitriptófano y cisteína se logró mediante la reacción intraanular de Savige-Fontana. Esto requiere una síntesis de péptidos en fase sólida compatible y un aminoácido ortogonal, ácido metiliminodiacético (MIDA), un grupo protector de boro, en 5 pasos. [12] Como paso final, se logró la oxidación enantioselectiva en el enlace triptationina utilizando un agente oxidante orgánico voluminoso y un sistema de solvente optimizado para producir el sulfóxido del enantiómero biorreactivo ( R ) deseado , completando la síntesis total . [ cita requerida ]
La α-amanitina tiene una atracción inusualmente fuerte y específica hacia la enzima ARN polimerasa II. Tras la ingestión y la absorción por las células hepáticas, se une a la enzima ARN polimerasa II, lo que provoca la citólisis de los hepatocitos (células del hígado). [14] Se han notificado pocos efectos en las 10 horas siguientes a la ingestión; no es raro que los efectos significativos tarden hasta 24 horas en aparecer, y este retraso en la aparición de los síntomas hace que la intoxicación por α-amanitina sea aún más difícil de diagnosticar y aún más peligrosa. Para entonces, ya ha pasado mucho tiempo desde que el lavado gástrico daría un resultado eficaz. La diarrea y los calambres son los primeros síntomas, pero pasan, dando una falsa señal de remisión. Normalmente, entre el cuarto y el quinto día, la toxina empieza a tener efectos graves en el hígado y los riñones , lo que provoca un fallo total del sistema en ambos. La muerte suele producirse alrededor de una semana después de la ingestión. [15]
Alrededor del 15% de los envenenados morirán en 10 días, progresando a través de una etapa comatosa a insuficiencia renal , insuficiencia hepática , coma hepático , insuficiencia respiratoria y muerte. Aquellos que se recuperan corren el riesgo de daño hepático permanente. [16] El diagnóstico es difícil y se establece mediante la observación de los síntomas clínicos, así como la presencia de α-amanitina en la orina . El análisis de orina generalmente es más útil dentro de las 48 horas posteriores a la ingestión. El tratamiento es principalmente de soporte ( lavado gástrico , carbón activado , reanimación con líquidos ), pero incluye varios medicamentos para contrarrestar las amatoxinas, incluida la penicilina intravenosa y los derivados de la cefalosporina y, en casos de mayor ingestión, puede extenderse a un trasplante de hígado ortotópico . El método más confiable para tratar la intoxicación por amanitina es mediante lavado gástrico inmediatamente después de la ingestión; sin embargo, la aparición de los síntomas generalmente es demasiado tarde para que esto sea una opción. La silibinina modificada químicamente , dihidrógeno disuccinato de silibinina disódico (nombre comercial Legalon SIL), una solución para administración intravenosa , se utiliza en el tratamiento de intoxicaciones graves con sustancias hepatotóxicas como el paracetamol y las amanitinas . [17]
Según un análisis de la estructura cristalina de 2002, la α-amanitina interactúa con la hélice puente en la ARN polimerasa II (pol II). [18] Esta interacción interfiere con la translocación de ARN y ADN necesaria para vaciar el sitio para la siguiente ronda de síntesis de ARN. La adición de α-amanitina puede reducir la tasa de translocación de la pol II en el ADN de varios miles a unos pocos nucleótidos por minuto, [19] [20] pero tiene poco efecto sobre la afinidad de la pol II por el trifosfato de nucleósido, [21] y aún se puede formar un enlace fosfodiéster. [22] [23] La hélice puente ha evolucionado para ser flexible y su movimiento es necesario para la translocación de la polimerasa a lo largo de la cadena principal del ADN. La unión de la α-amanitina pone una restricción en su movilidad, por lo que ralentiza la translocación de la polimerasa y la tasa de síntesis de la molécula de ARN. [ cita requerida ]
Una nueva tecnología de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) basada en α-amanitina ha mostrado actividad en células tumorales resistentes a la terapia, por ejemplo, células que expresan transportadores resistentes a múltiples fármacos, células iniciadoras de tumores y células que no se dividen en concentraciones picomolares. [24]
El modo de acción único de la α-amanitina parece hacer que los ADC basados en amanitina sean una carga tóxica adecuada. [25] La amanitina tiene una estructura soluble en agua, lo que da como resultado ADC con baja tendencia a la agregación. [26] [27]
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