El intercambio de hidrógeno-deuterio (también llamado intercambio H–D o intercambio H/D) es una reacción química en la que un átomo de hidrógeno unido mediante enlaces covalentes se reemplaza por un átomo de deuterio , o viceversa. Se puede aplicar más fácilmente a protones y deuterones intercambiables, donde dicha transformación ocurre en presencia de una fuente de deuterio adecuada, sin ningún catalizador. El uso de catalizadores ácidos, básicos o metálicos, junto con condiciones de mayor temperatura y presión, puede facilitar el intercambio de átomos de hidrógeno no intercambiables, siempre que el sustrato sea resistente a las condiciones y reactivos empleados. Esto a menudo da como resultado la perdeuteración: intercambio de hidrógeno-deuterio de todos los átomos de hidrógeno no intercambiables en una molécula.
Un ejemplo de protones intercambiables que se examinan comúnmente de esta manera son los protones de las amidas en la cadena principal de una proteína . [1] [2] [3] El método proporciona información sobre la accesibilidad al disolvente de varias partes de la molécula y, por lo tanto, la estructura terciaria de la proteína. El marco teórico para comprender el intercambio de hidrógeno en las proteínas fue descrito por primera vez por Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang y fue el primero en aplicar el intercambio H/D para estudiar las proteínas. [4]
En una solución prótica, los protones intercambiables, como los del grupo hidroxilo o amina, intercambian protones con el disolvente . Si el disolvente es D2O , se incorporarán deuterones en estas posiciones. La reacción de intercambio se puede seguir utilizando una variedad de métodos (véase Detección). Dado que este intercambio es una reacción de equilibrio, la cantidad molar de deuterio debe ser alta en comparación con los protones intercambiables del sustrato. Por ejemplo, se añade deuterio a una proteína en H2O diluyendo la solución de H2O con D2O ( p. ej., diez veces). Por lo general, el intercambio se realiza a un pH fisiológico (7,0–8,0) donde las proteínas están en su conjunto más nativo de estados conformacionales. [5] [6]
La reacción de intercambio H/D también puede ser catalizada por catalizadores ácidos, básicos o metálicos como el platino. Para los átomos de hidrógeno de la amida de la cadena principal de las proteínas, la tasa de intercambio mínima ocurre aproximadamente a un pH de 2,6, en promedio. Al realizar el intercambio a un pH neutro y luego cambiar rápidamente el pH, las tasas de intercambio de los hidrógenos de la amida de la cadena principal se pueden ralentizar drásticamente o extinguir . El pH al que se extingue la reacción depende del método de análisis. Para la detección por RMN, el pH se puede mover a alrededor de 4,0-4,5. Para la detección por espectrometría de masas, el pH se reduce al mínimo de la curva de intercambio, pH 2,6. En el experimento más básico, se permite que la reacción tenga lugar durante un tiempo determinado antes de extinguirse.
El patrón de deuteración de una molécula que ha experimentado un intercambio H/D se puede mantener en entornos apróticos. Sin embargo, algunos métodos de análisis de deuteración para moléculas como las proteínas se realizan en solución acuosa, lo que significa que el intercambio continuará a un ritmo lento incluso después de que se detenga la reacción. El intercambio no deseado de deuterio-hidrógeno se conoce como intercambio inverso y se han ideado varios métodos para corregirlo.
El intercambio H-D fue medido originalmente por el padre del intercambio de hidrógeno Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang utilizando tubos de gradiente de densidad. En la época moderna, el intercambio H-D se ha monitoreado principalmente mediante los métodos: espectroscopia de RMN , espectrometría de masas y cristalografía de neutrones . Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas y desventajas.
Los núcleos de hidrógeno y deuterio son muy diferentes en sus propiedades magnéticas. Por lo tanto, es posible distinguirlos mediante espectroscopia de RMN . Los deuterones no se observarán en un espectro de RMN de 1 H y, a la inversa, los protones no se observarán en un espectro de RMN de 2 H. Cuando se observan pequeñas señales en un espectro de RMN de 1 H de una muestra altamente deuterada, se las denomina señales residuales. Se pueden utilizar para calcular el nivel de deuteración en una molécula. No se observan señales análogas en los espectros de RMN de 2 H debido a la baja sensibilidad de esta técnica en comparación con el análisis de 1 H. Los deuterones suelen exhibir desplazamientos químicos muy similares a sus protones análogos. El análisis mediante espectroscopia de RMN de 13 C también es posible: los diferentes valores de espín del hidrógeno ( 1 / 2 ) y el deuterio (1) dan lugar a diferentes multiplicidades de desdoblamiento. La espectroscopia de RMN se puede utilizar para determinar la deuteración específica del sitio de las moléculas.
Otro método utiliza espectros HSQC. Normalmente, los espectros HSQC se registran en una serie de puntos de tiempo mientras el hidrógeno se intercambia con el deuterio. Dado que el experimento HSQC es específico para el hidrógeno, la señal decaerá exponencialmente a medida que el hidrógeno se intercambia. Entonces es posible ajustar una función exponencial a los datos y obtener la constante de intercambio. Este método proporciona información específica de residuos para todos los residuos de la proteína simultáneamente [7] [8] El principal inconveniente es que requiere una asignación previa del espectro para la proteína en cuestión. Esto puede requerir mucho trabajo y, por lo general, limita el método a proteínas menores de 25 kDa . Debido a que lleva minutos u horas registrar un espectro HSQC, las amidas que se intercambian rápidamente deben medirse utilizando otras secuencias de pulsos.
La espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HX-MS o HDX-MS) puede determinar el contenido total de deuterio de las moléculas que han sufrido un intercambio H/D. Debido a la preparación de la muestra requerida, generalmente se considera que proporciona una medición precisa solo de los átomos de hidrógeno no intercambiables. También puede implicar un intercambio H/D en la fase gaseosa [9] o un intercambio en fase de solución antes de la ionización. [3] Tiene varias ventajas en la espectroscopia de RMN con respecto al análisis de las reacciones de intercambio H–D: se necesita mucho menos material, la concentración de la muestra puede ser muy baja (tan baja como 0,1 uM), el límite de tamaño es mucho mayor y, por lo general, los datos se pueden recopilar e interpretar mucho más rápidamente. [10]
El núcleo de deuterio es dos veces más pesado que el núcleo de hidrógeno porque contiene un neutrón además de un protón. Por lo tanto, una molécula que contenga algo de deuterio será más pesada que una que contenga solo hidrógeno. A medida que una proteína se deutera cada vez más, la masa molecular aumenta en consecuencia. La detección del cambio en la masa de una proteína tras la deuteración fue posible gracias a la moderna espectrometría de masas de proteínas, descrita por primera vez en 1991 por Katta y Chait. [11]
La determinación de la deuteración específica del sitio mediante espectrometría de masas es más complicada que mediante espectroscopia de RMN. Por ejemplo, la ubicación y la cantidad relativa de intercambio de deuterio a lo largo de la cadena principal del péptido se pueden determinar de forma aproximada sometiendo la proteína a proteólisis después de que se haya extinguido la reacción de intercambio. A continuación, se analizan los péptidos individuales para determinar la deuteración general de cada fragmento de péptido. Con esta técnica, la resolución del intercambio de deuterio se determina por el tamaño de los péptidos producidos durante la digestión. [12] La pepsina , una proteasa ácida , se utiliza habitualmente para la proteólisis, ya que el pH de extinción debe mantenerse durante la reacción proteolítica. Para minimizar el retrointercambio, la proteólisis y el posterior análisis de espectrometría de masas deben realizarse lo más rápido posible. La separación por HPLC del digesto péptico se lleva a cabo a menudo a baja temperatura justo antes de la espectrometría de masas por electrospray para minimizar el retrointercambio. Más recientemente, se ha utilizado UPLC debido a sus capacidades superiores de separación. [13]
En 1999 se propuso que podría ser posible lograr la resolución de un solo residuo mediante el uso de la fragmentación por disociación inducida por colisión (CID) de péptidos deuterados junto con la espectrometría de masas en tándem . Pronto se descubrió que la CID causa "alteración" de la posición del deuterio dentro de los péptidos. [14] [15] Sin embargo, la fragmentación producida por la desintegración en la fuente MALDI (ISD), la disociación por captura de electrones (ECD) y la disociación por transferencia de electrones (ETD) se producen con poca o ninguna alteración en las condiciones experimentales correctas. [16] [17] [18] La alteración del etiquetado isotópico es causada por el calentamiento por colisión antes de la disociación del ion y, si bien la CID causa alteración, el calentamiento por colisión también puede ocurrir durante la ionización y el transporte de iones. [19] Sin embargo, mediante una optimización cuidadosa de los parámetros del instrumento que causan el calentamiento de iones, la codificación de hidrógeno se puede minimizar a un grado que preserva el etiquetado isotópico en fase de solución hasta que se puede realizar la fragmentación utilizando una técnica donde no se produce codificación. [17] [18] [20] [21] Más recientemente, la fotodisociación ultravioleta (UVPD) también se ha investigado como una posible técnica de fragmentación para localizar deuterio dentro de péptidos y proteínas. [22] [23] En este sentido, las conclusiones han sido mixtas, mientras que es posible obtener fragmentos UVPD que no han sufrido codificación bajo ciertas condiciones, otros han demostrado que la codificación puede ocurrir tanto para péptidos como para proteínas durante el paso de fragmentación UVPD en sí. [22] [23] La teoría que consolida estas aparentes contradicciones tiene que ver con la vía de fragmentación dual que puede surgir de la irradiación UV de péptidos y proteínas, es decir, disociación directa y estadística. [24] Es decir, si las condiciones experimentales favorecen la disociación directa y el ion precursor se mantiene a bajas energías internas antes y durante la fragmentación, el nivel de deuterio de los fragmentos resultantes corresponderá al precursor no desordenado. [22] Sin embargo, las condiciones experimentales pueden favorecer la disociación estadística durante la irradiación UV, especialmente en tiempos de irradiación largos y baja presión de gas, lo que lleva a la conversión interna de la energía de excitación electrónica aportada por los fotones UV. [23] El resultado es la excitación vibracional de la molécula irradiada que a su vez sufre desorden.
El intercambio de hidrógeno-deuterio de especies de intercambio rápido (por ejemplo, grupos hidroxilo) se puede medir con resolución atómica cuantitativamente mediante cristalografía de neutrones y en tiempo real si el intercambio se realiza durante el experimento de difracción.
Los haces de neutrones de alta intensidad se generan generalmente por espalación en aceleradores de partículas linac como la fuente de neutrones por espalación . Los neutrones difractan los cristales de forma similar a los rayos X y se pueden utilizar para la determinación estructural. Los átomos de hidrógeno, con entre uno y cero electrones en un entorno biológico, difractan mal los rayos X y son prácticamente invisibles en condiciones experimentales normales. Los neutrones se dispersan desde los núcleos atómicos y, por lo tanto, son capaces de detectar átomos de hidrógeno y deuterio.
Los átomos de hidrógeno se reemplazan rutinariamente con deuterio, lo que introduce un factor de dispersión fuerte y positivo. A menudo es suficiente reemplazar solo los átomos de hidrógeno lábiles y del solvente en un cristal de proteína mediante difusión de vapor. En una estructura de este tipo, la ocupación de un átomo de deuterio intercambiable en un cristal se refinará del 0 al 100%, cuantificando directamente la cantidad de intercambio.
La perdeuteración de un componente de un sistema multicomponente puede proporcionar contraste para experimentos de dispersión de neutrones , donde el contraste obtenido mediante el uso de solventes deuterados es insuficiente. [ cita requerida ]
No es posible determinar la estructura de una proteína con intercambio H/D de otra manera que no sea mediante cristalografía neutrónica, ni tampoco es posible definir elementos estructurales secundarios. Las razones de esto están relacionadas con la forma en que la estructura de la proteína ralentiza el intercambio. Las tasas de intercambio son una función de dos parámetros: la accesibilidad al disolvente y los enlaces de hidrógeno. Por lo tanto, una amida que forma parte de un enlace de hidrógeno intramolecular se intercambiará lentamente, si es que lo hace, mientras que una amida en la superficie de la proteína unida al agua mediante enlaces de hidrógeno se intercambiará rápidamente. Las amidas enterradas lejos del disolvente pero no unidas mediante enlaces de hidrógeno también pueden tener tasas de intercambio muy lentas. Debido a que tanto la accesibilidad al disolvente como los enlaces de hidrógeno contribuyen a la tasa de intercambio, resulta difícil atribuir una tasa de intercambio dada a un elemento estructural sin datos estructurales de cristalografía o RMN.
El intercambio H–D se ha utilizado para caracterizar la vía de plegamiento de las proteínas, mediante el replegamiento de la proteína en condiciones de intercambio. En un experimento de intercambio directo (H a D), se añade un pulso de deuterio después de varias cantidades de tiempo de replegamiento. Las partes de la estructura que se forman rápidamente estarán protegidas y, por lo tanto, no se intercambiarán, mientras que las áreas que se pliegan más tarde en la vía estarán expuestas al intercambio durante períodos de tiempo más largos. Por lo tanto, el intercambio H/D se puede utilizar para determinar la secuencia de varios eventos de plegamiento. Los factores que determinan la resolución temporal de este enfoque son la eficiencia de la mezcla y la rapidez con la que se puede realizar la extinción después del etiquetado.
El intercambio H–D se ha utilizado para caracterizar las estructuras proteínicas [25] y las interacciones proteína-proteína. [26] La reacción de intercambio debe llevarse a cabo con las proteínas aisladas y con el complejo. Luego se comparan las regiones de intercambio. Si una región está enterrada por la unión, las amidas en esta región pueden estar protegidas en el complejo e intercambiarse lentamente. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el intercambio H–D no se puede utilizar para localizar las interfaces de unión para todas las interacciones proteína-proteína. Algunas interacciones proteína-proteína son impulsadas por fuerzas electrostáticas de las cadenas laterales y es poco probable que cambien la tasa de intercambio de los hidrógenos de la amida de la cadena principal, en particular si los hidrógenos de la amida se encuentran en elementos estructurales estables como las hélices alfa .
Por último, el intercambio H–D se puede utilizar para monitorear los cambios conformacionales en las proteínas en relación con su función. Si la conformación se altera como resultado de una modificación postraduccional , activación enzimática, unión de fármacos u otros eventos funcionales, es probable que se produzca un cambio en el intercambio H/D que se pueda detectar. [27]
HDXsite es un servidor web en línea que incluye algunas aplicaciones como el modelador HDX que aumenta la resolución de los datos HDX experimentales y modela factores de protección para residuos individuales. [28] [29]