El inmunomarcaje es un proceso bioquímico que permite la detección y localización de un antígeno en un sitio particular dentro de una célula, tejido u órgano. Los antígenos son moléculas orgánicas, normalmente proteínas , capaces de unirse a un anticuerpo . Estos antígenos se pueden visualizar utilizando una combinación de anticuerpos específicos de antígeno, así como un medio de detección, llamado etiqueta, que está unido covalentemente al anticuerpo. [1] Si el proceso de inmunomarcaje tiene como objetivo revelar información sobre una célula o sus subestructuras, el proceso se llama inmunocitoquímica . [2] El inmunomarcaje de estructuras más grandes se llama inmunohistoquímica . [3]
Hay dos pasos complejos en la fabricación de anticuerpos para inmunomarcaje. El primero produce el anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés y el segundo fusiona la etiqueta con el anticuerpo. Dado que no es práctico fusionar una etiqueta con cada anticuerpo específico de antígeno imaginable, la mayoría de los procesos de inmunomarcaje utilizan un método de detección indirecto. Este método indirecto emplea un anticuerpo primario que es específico de antígeno y un anticuerpo secundario fusionado a una etiqueta que se une específicamente al anticuerpo primario. Este enfoque indirecto permite la producción en masa de anticuerpos secundarios que se pueden comprar en el mercado. [4] Según este método indirecto, el anticuerpo primario se añade al sistema de prueba. El anticuerpo primario busca y se une al antígeno objetivo. Posteriormente se añade el anticuerpo secundario marcado, diseñado para unirse exclusivamente al anticuerpo primario.
Las etiquetas típicas incluyen: un compuesto fluorescente , cuentas de oro, una etiqueta de epítopo particular [5] o una enzima que produce un compuesto coloreado. La asociación de las etiquetas al objetivo a través de los anticuerpos permite la identificación y visualización del antígeno de interés en su ubicación nativa en el tejido, como la membrana celular , el citoplasma o la membrana nuclear . Bajo ciertas condiciones el método puede adaptarse para proporcionar información cuantitativa. [4]
El inmunomarcaje se puede utilizar en farmacología , biología molecular , bioquímica y cualquier otro campo donde sea importante conocer la ubicación precisa de una molécula que se puede unir a un anticuerpo. [6] [7] [8]
Hay dos métodos involucrados en el inmunomarcaje, el método directo y el indirecto. En el método directo de inmunomarcaje, el anticuerpo primario se conjuga directamente con la etiqueta. [9] El método directo es útil para minimizar la reacción cruzada , una medida de inespecificidad que es inherente a todos los anticuerpos y que se multiplica con cada anticuerpo adicional utilizado para detectar un antígeno. Sin embargo, el método directo es mucho menos práctico que el método indirecto y no se utiliza habitualmente en los laboratorios, ya que los anticuerpos primarios deben marcarse covalentemente, lo que requiere un suministro abundante de anticuerpo purificado. Además, el método directo es potencialmente mucho menos sensible que el método indirecto. [10] Dado que varios anticuerpos secundarios son capaces de unirse a diferentes partes o dominios de un único anticuerpo primario que se une al antígeno objetivo, hay más anticuerpos marcados asociados con cada antígeno. Más etiqueta por antígeno da como resultado más señal por antígeno. [11]
Se pueden emplear diferentes métodos indirectos para lograr altos grados de especificidad y sensibilidad. En primer lugar, a menudo se utilizan protocolos de dos pasos para evitar la reacción cruzada entre el inmunomarcaje de múltiples mezclas de anticuerpos primarios y secundarios , donde con frecuencia se utilizan anticuerpos de unión a antígeno de fragmentos secundarios. En segundo lugar, se pueden utilizar anticuerpos primarios haptenilados, donde el anticuerpo secundario puede reconocer el hapteno asociado . El hapteno está unido covalentemente al anticuerpo primario mediante imidésteres de succinilo o secciones Fab específicas de IgG Fc conjugadas. Por último, los anticuerpos monoclonales primarios que tienen diferentes isotipos de Ig pueden detectarse mediante anticuerpos secundarios específicos que están contra el isotipo de interés. [10]
En general, los anticuerpos deben unirse a los antígenos con una alta especificidad y afinidad. [12] La especificidad de la unión se refiere a la capacidad de un anticuerpo para unirse y unirse únicamente a un único antígeno objetivo. Los científicos suelen utilizar anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales , que están compuestos de péptidos sintéticos. Durante la fabricación de estos anticuerpos, los anticuerpos específicos de antígeno se secuestran uniendo el péptido antigénico a una columna de afinidad y permitiendo que el anticuerpo no específico simplemente pase a través de la columna. Esto disminuye la probabilidad de que los anticuerpos se unan a un epítopo no deseado del antígeno que no se encuentra en el péptido inicial. Por tanto, la especificidad del anticuerpo se establece mediante la reacción específica con la proteína o péptido que se utiliza para la inmunización mediante métodos específicos, como la inmunotransferencia o la inmunoprecipitación . [13]
Para establecer la especificidad de los anticuerpos, el factor clave es el tipo de péptidos sintéticos o proteínas purificadas que se utilizan. Cuanto menor sea la especificidad del anticuerpo, mayores serán las posibilidades de visualizar algo distinto al antígeno objetivo. En el caso de los péptidos sintéticos, la ventaja es que la secuencia de aminoácidos es fácilmente accesible, pero los péptidos no siempre se parecen a la estructura tridimensional o la modificación postraduccional que se encuentra en la forma nativa de la proteína. Por lo tanto, los anticuerpos que se producen para actuar contra un péptido sintético pueden tener problemas con la proteína tridimensional nativa. Estos tipos de anticuerpos darían resultados deficientes en experimentos de inmunoprecipitación o inmunohistoquímica ; sin embargo, los anticuerpos pueden ser capaces de unirse a la forma desnaturalizada de la proteína durante una prueba de inmunotransferencia. Por el contrario, si el anticuerpo funciona bien para proteínas purificadas en su forma nativa y no desnaturalizadas , una inmunotransferencia no puede usarse como prueba estandarizada para determinar la especificidad de la unión del anticuerpo, particularmente en inmunohistoquímica. [14]
La microscopía óptica es el uso de un microscopio óptico , que es un instrumento que requiere el uso de luz para ver la muestra ampliada. En general, se utiliza con frecuencia un microscopio óptico compuesto, donde dos lentes, el ocular y el objetivo trabajan simultáneamente para generar el aumento de la muestra. [15] La microscopía óptica utiliza con frecuencia el inmunomarcaje para observar células o tejidos específicos. Por ejemplo, se realizó un estudio para observar la morfología y la producción de hormonas en cultivos de células de adenoma hipofisario mediante microscopía óptica y otros métodos de microscopía electrónica. Este tipo de microscopía confirmó que los cultivos de células de adenoma primario mantienen sus características fisiológicas in vitro , lo que coincidió con la inspección histológica. Además, se observaron cultivos celulares de adenomas hipofisarios humanos mediante microscopía óptica e inmunocitoquímica, donde estas células se fijaron e inmunomarcaron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra la GH humana y un anticuerpo policlonal de conejo contra la PRL. Este es un ejemplo de cómo un cultivo celular inmunomarcado de células de adenoma hipofisario que se observaron mediante microscopía óptica y otras técnicas de microscopía electrónica puede ayudar con el diagnóstico adecuado de los tumores. [dieciséis]
La microscopía electrónica (ME) es un área de la ciencia especializada que utiliza el microscopio electrónico como herramienta para observar tejidos. [17] La microscopía electrónica tiene un nivel de aumento de hasta 2 millones de veces, mientras que la microscopía óptica solo tiene un nivel de aumento de hasta 1000-2000 veces. [18] Hay dos tipos de microscopios electrónicos, el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido . [17]
La microscopía electrónica es un método común que utiliza la técnica de inmunomarcaje para ver tejidos o células marcados. El método del microscopio electrónico sigue muchos de los mismos conceptos que el inmunomarcaje para microscopía óptica, donde el anticuerpo particular puede reconocer la ubicación del antígeno de interés y luego ser visto por el microscopio electrónico. La ventaja de la microscopía electrónica sobre la microscopía óptica es la capacidad de ver las áreas objetivo a nivel subcelular. Generalmente, para EM se utiliza un metal pesado que es denso en electrones, que puede reflejar los electrones incidentes. El inmunomarcaje generalmente se confirma utilizando el microscopio óptico para asegurar la presencia del antígeno y luego se realiza un seguimiento con el microscopio electrónico. [19]
A menudo se utilizan el inmunomarcaje y la microscopía electrónica para observar los cromosomas . Se llevó a cabo un estudio para ver posibles mejoras en el inmunomarcaje de estructuras cromosómicas, como la topoisomerasa IIα y la condensina en cromosomas mitóticos disecados. En particular, estos investigadores utilizaron irradiación UV de núcleos separados o mostraron cómo los cromosomas ayudan mediante altos niveles de inmunomarcaje específico, que fueron observados mediante microscopía electrónica. [20]
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) utiliza un microscopio electrónico de transmisión para formar una imagen bidimensional disparando electrones a través de una fina pieza de tejido. Cuanto más brillantes sean ciertas áreas en la imagen, más electrones podrán moverse a través de la muestra. [17] La microscopía electrónica de transmisión se ha utilizado como una forma de ver células y tejidos inmunomarcados. Por ejemplo, TEM puede observar las bacterias cuando se aplica el inmunomarcaje. Se realizó un estudio para examinar las estructuras de las fimbrias CS3 y CS6 en diferentes cepas de Escherichia coli , que fueron detectadas mediante TEM seguida de tinción negativa e inmunomarcaje. Más concretamente, el inmunomarcaje de las fimbrias confirmó la existencia de diferentes antígenos de superficie. [21]
La microscopía electrónica de barrido (SEM) utiliza un microscopio electrónico de barrido, que produce imágenes grandes que se perciben como tridimensionales cuando, en realidad, no lo son. Este tipo de microscopio concentra un haz de electrones a través de un área muy pequeña (2-3 nm) de la muestra para producir electrones a partir de dicha muestra. Estos electrones secundarios son detectados por un sensor y la imagen de la muestra se genera durante un período de tiempo determinado. [17]
La microscopía electrónica de barrido es una técnica de inmunomarcaje de uso frecuente. SEM es capaz de detectar la superficie de componentes celulares en alta resolución. Esta técnica de inmunomarcaje es muy similar al método de inmunofluorescencia, pero se utiliza una etiqueta de oro coloidal en lugar de un fluoróforo. En general, los conceptos son muy paralelos en el sentido de que se utiliza un anticuerpo primario no conjugado y seguido secuencialmente por un anticuerpo secundario marcado que actúa contra el anticuerpo primario. [22] A veces, el SEM junto con el inmunomarcaje de partículas de oro es problemático con respecto a la resolución de partículas y cargas bajo el haz de electrones; sin embargo, este problema de resolución se ha resuelto mediante la mejora de la instrumentación SEM mediante imágenes de electrones retrodispersados. [23] Esto se debe a que los patrones de difracción de electrones retrodispersados proporcionan una superficie limpia de la muestra para interactuar con el haz de electrones primario. [24]
El inmunomarcaje con partículas de oro, también conocido como tinción con inmunooro , se utiliza regularmente con microscopía electrónica de barrido y microscopía electrónica de transmisión para identificar con éxito el área dentro de las células y tejidos donde se encuentran los antígenos. [23] La técnica de etiquetado de partículas de oro fue publicada por primera vez por Faulk, W. y Taylor, G. cuando pudieron etiquetar partículas de oro con gammaglobulinas de conejo anti-salmonella en un solo paso para identificar la ubicación de los antígenos de salmonella. . [23] [25]
Los estudios han demostrado que el tamaño de la partícula de oro debe ampliarse (>40 nm) para ver las células con un aumento bajo, pero las partículas de oro que son demasiado grandes pueden disminuir la eficiencia de la unión de la etiqueta de oro. Los científicos han llegado a la conclusión de que el uso de partículas de oro más pequeñas (1-5 nm) debería ampliarse y mejorarse con plata. Aunque la tinción con tetróxido de osmio puede rayar la plata, se descubrió que la mejora de las partículas de oro no es susceptible de rayarse con la tinción con tetróxido de osmio; por lo tanto, muchos estudios de adhesión celular de diferentes sustratos pueden utilizar el mecanismo de etiquetado con inmunooro mediante la mejora de las partículas de oro. [26]
Se han realizado investigaciones para probar la compatibilidad del inmunomarcaje con las huellas dactilares. A veces, las huellas dactilares no son lo suficientemente claras como para reconocer el patrón de las crestas. El inmunoetiquetado puede ser una forma para que el personal forense determine quién dejó la huella. Los investigadores llevaron a cabo un estudio que probó la compatibilidad del inmunomarcaje con muchas técnicas de desarrollo de huellas dactilares. Descubrieron que indanediona-zinc (IND-ZnCl), IND-ZnCl seguido de pulverización con ninhidrina (IND-NIN), revelador físico (PD), ahumado con cianoacrilato (CA), cianoacrilato seguido de tinción amarilla básica (CA-BY), lumicianoacrilato el ahumado (Lumi-CA) y el ahumado con policianoacrilato (Poly-CA) fueron compatibles con el inmunomarcaje. [27] El inmunoetiquetado no sólo puede extraer información del perfil del donante a partir de las huellas dactilares, sino que también puede mejorar la calidad de las huellas dactilares, lo que sería beneficioso en un caso forense.
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