Inmunoelectroforesis es un nombre general para una serie de métodos bioquímicos para la separación y caracterización de proteínas basados en electroforesis y reacción con anticuerpos . Todas las variantes de inmunoelectroforesis requieren inmunoglobulinas , también conocidas como anticuerpos , que reaccionen con las proteínas que se van a separar o caracterizar. Los métodos se desarrollaron y utilizaron ampliamente durante la segunda mitad del siglo XX. En orden algo cronológico: análisis inmunoelectroforético (inmunoelectroforesis unidimensional ad modum Grabar), inmunoelectroforesis cruzada (inmunoelectroforesis cuantitativa bidimensional ad modum Clarke y Freeman o ad modum Laurell), inmunoelectroforesis cohete (inmunoelectroforesis cuantitativa unidimensional ad modum Laurell), inmunoelectroforesis con cohetes fusionados ad modum Svendsen y Harboe, inmunoelectroforesis de afinidad ad modum Bøg-Hansen.
La inmunoelectroforesis es un término general que describe muchas combinaciones de los principios de la electroforesis y la reacción de anticuerpos , también conocida como inmunodifusión. [1]
Tradicionalmente se prefiere la agarosa en forma de placas de gel al 1% de aproximadamente 1 mm de espesor tamponadas a un pH alto (alrededor de 8,6) para la electroforesis y la reacción con anticuerpos. Se eligió la agarosa como matriz del gel porque tiene poros grandes que permiten el libre paso y la separación de proteínas pero proporciona un anclaje para los inmunoprecipitados de proteínas y anticuerpos específicos. Se eligió el pH alto porque los anticuerpos son prácticamente inmóviles a un pH alto. Para la electroforesis normalmente se recomendaba un equipo de electroforesis con una placa de enfriamiento horizontal.
Los inmunoprecipitados son visibles en el gel de agarosa húmedo, pero se tiñen con tintes de proteínas como el azul brillante de Coomassie en el gel seco. A diferencia de la electroforesis en gel SDS , la electroforesis en agarosa permite condiciones nativas, preservando la estructura nativa y las actividades de las proteínas bajo investigación, por lo tanto, la inmunoelectroforesis permite la caracterización de las actividades enzimáticas y la unión de ligandos, etc., además de la separación electroforética.
La contrainmunoelectroforesis es la combinación de inmunodifusión con electroforesis. En esencia, la electroforesis acelera el proceso de juntar los reactivos.
El análisis inmunoelectroforético ad modum Grabar es el método clásico de inmunoelectroforesis. Las proteínas se separan mediante electroforesis, luego los anticuerpos se aplican en una cubeta junto a las proteínas separadas y se forman inmunoprecipitados después de un período de difusión de las proteínas separadas y los anticuerpos entre sí. La introducción del análisis inmunoelectroforético dio un gran impulso a la química de las proteínas; uno de los primeros resultados fue la resolución de las proteínas en fluidos biológicos y extractos biológicos. Entre las observaciones importantes realizadas se encuentran la gran cantidad de proteínas diferentes en el suero, la existencia de varias clases de inmunoglobulinas y su heterogeneidad electroforética.
La inmunoelectroforesis cruzada también se denomina inmunoelectroforesis cuantitativa bidimensional ad modum Clarke y Freeman o ad modum Laurell. En este método, las proteínas se separan primero durante la electroforesis de la primera dimensión y luego, en lugar de la difusión hacia los anticuerpos, las proteínas se someten a electroforesis en un gel que contiene anticuerpos en la segunda dimensión. La inmunoprecipitación tendrá lugar durante la electroforsis de segunda dimensión y los inmunoprecipitados tienen una forma de campana característica, cada precipitado representa un antígeno, y la posición del precipitado depende de la cantidad de proteína así como de la cantidad de anticuerpo específico en el gel, por lo que Se puede realizar una cuantificación relativa. La sensibilidad y el poder de resolución de la inmunoelectroforesis cruzada son superiores a los del análisis inmunoelectroforético clásico y existen múltiples variaciones de la técnica útiles para diversos fines. La inmunoelectroforesis cruzada se ha utilizado para estudios de proteínas en fluidos biológicos, particularmente suero humano, y extractos biológicos.
La inmunoelectroforesis con cohetes es una inmunoelectroforesis cuantitativa unidimensional. El método se ha utilizado para la cuantificación de proteínas séricas humanas antes de que estuvieran disponibles los métodos automatizados.
La inmunoelectroforesis con cohetes fusionados es una modificación de la inmunoelectroforesis cuantitativa unidimensional que se utiliza para la medición detallada de proteínas en fracciones de experimentos de separación de proteínas.
La inmunoelectroforesis de afinidad se basa en cambios en el patrón electroforético de proteínas mediante interacción específica o formación de complejos con otras macromoléculas o ligandos. La inmunoelectroforesis de afinidad se ha utilizado para estimar constantes de unión , como por ejemplo con lectinas o para caracterizar proteínas con características específicas como contenido de glucano o unión a ligando . Algunas variantes de la inmunoelectroforesis de afinidad son similares a la cromatografía de afinidad mediante el uso de ligandos inmovilizados .
Unión de ligandos. La estructura abierta del inmunoprecipitado en el gel de agarosa permitirá la unión adicional de anticuerpos marcados radiactivamente y otros ligandos para revelar proteínas específicas. La aplicación de esta posibilidad se ha utilizado, por ejemplo, para la identificación de alérgenos mediante reacción con inmunoglobulina E (IgE) y para la identificación de glicoproteínas con lectinas .
Comentarios generales. Dos factores determinan que los métodos inmunoelectroforéticos no se utilicen ampliamente. En primer lugar, requieren bastante trabajo y cierta experiencia manual. En segundo lugar, requieren cantidades bastante grandes de anticuerpos policlonales. Hoy en día, la electroforesis en gel seguida de electrotransferencia es el método preferido para la caracterización de proteínas debido a su facilidad de operación, su alta sensibilidad y su bajo requerimiento de anticuerpos específicos. Además, las proteínas se separan mediante electroforesis en gel basándose en su peso molecular aparente, lo que no se logra mediante inmunoelectroforesis, aunque los métodos inmunoelectroforéticos siguen siendo útiles cuando se necesitan condiciones no reductoras.
Contrainmunoelectroforesis y su modificación.
En comparación con otros métodos convencionales de diagnóstico, por ejemplo, las pruebas de infección viral, la contrainmunoelectroforesis es un método muy específico, simple y rápido que no requiere herramientas sofisticadas y costosas, ni materiales de entrada ni desarrollo de capacidades a largo plazo. Teniendo en cuenta el alto contenido informativo de la contrainmunoelectroforesis, los resultados en la práctica pueden ser a veces dudosos. Como resultado, al utilizar un copolímero anfifílico que contiene fluoresceína fabricado para aumentar la interacción entre antígeno y anticuerpo, se pueden mejorar los procedimientos de contrainmunoelectroforesis. Según los hallazgos, el uso de la mezcla de copolímero de fluoresceína y antígeno mejoró la asociación con los niveles plasmáticos de anticuerpos de los animales inmunizados contra la enfermedad hemorrágica y aumentó la concentración de proteínas en la zona precipitada. La capacidad del copolímero de fluoresceína anfifílico para estimular la asociación antígeno-anticuerpo y ver el dominio de acumulación fluorescente puede mejorar la eficiencia de la contrainmunoelectroforesis para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas. [3]
Inmunométodos
Las terminologías, métodos inmunológicos y técnicas inmunoquímicas se refieren a una variedad de procesos de inmunoelectroforesis cuyos resultados se identifican utilizando anticuerpos y metodologías inmunológicas. [4] Como resultado, la gran sensibilidad de los inmunométodos es beneficiosa en comparación con el gran gasto que supone utilizar anticuerpos. Se utilizan muchos tipos diferentes de electroforesis en agarosa para ver cómo viajan las proteínas en diversas circunstancias. Las proteínas se reconocen una vez transcurrido el tiempo incubando geles con determinados anticuerpos, que luego se tiñen con azul de Comassie. [5]
Inmunodifusión radial
La inmunodifusión radial es una técnica de inmunoensayo para determinar la concentración de una proteína particular en una mezcla que incluye otros módulos. Está compuesto por un gel de agarosa, como los demás. Además, en este procedimiento, los materiales se colocan en pocillos redondos en la parte central del gel y se dispersan a través de él, generando un anillo de deposición con un diámetro en relación con la cantidad de proteína no unida que se ha difundido. [4]
Identificación de interacción de nanomateriales con complemento proteico C3 e inmunoelectroforesis 2D.
La inmunoelectroforesis 2D es un método potencial que puede usarse para una variedad de funciones que involucran el flujo de proteínas de los migrantes, como el examen profundo de la opsonización de proteínas, en sucesión de la primera dimensión como una actividad de la masa molar de la proteína y la segunda dimensión como una función de el punto isoeléctrico. A pesar de que contiene una gran cantidad de proteínas, cada punto en el gel 2D simbolizará una proteína particular con una masa molecular y una característica específicas. [5]
La inmunoelectroforesis 2D también se proporciona como una herramienta valiosa para examinar la estimulación de la vía de transducción de señales, que es un factor esencial en la investigación de nanopartículas antes de su entrega in vivo, porque afectará la longevidad, el destino y la biodistribución de las nanopartículas. Este método emplea electroforesis bidimensional de proteínas de agarosa horizontalmente para identificar específicamente la asociación de nanopartículas con la proteína C3. Las proteínas se pueden separar en la primera dimensión según su masa molecular (cuanto más corta es la proteína, más lejos se desplaza), y en la segunda dimensión según su abundancia [6].
Algunas limitaciones de la inmunoelectroforesis.
Aunque la inmunoelectroforesis tiene una serie de ventajas, también tiene ciertas desventajas, como por ejemplo, en comparación con otros métodos de electroforesis, como la inmunofijación, este método es lento y menos preciso. Puede resultar difícil interpretar los resultados. Varias proteínas monoclonales diminutas pueden ser más difíciles de identificar. La accesibilidad de determinados anticuerpos limita su utilidad en técnicas analíticas. La inmunoelectroforesis tradicional (clásica o convencional) tiene una serie de inconvenientes, incluido el hecho de que lleva mucho tiempo y el protocolo puede tardar hasta 3 días en finalizar, tiene una especificidad y sensibilidad limitadas y los resultados pueden ser difíciles de leer. Como resultado, las técnicas de inmunoelectroforesis más nuevas han suplantado en gran medida a la inmunoelectroforesis convencional.